单细胞分离检验技术在法医学中的应用-精品文档.docx

单细胞分离检验技术在法医学中的应用生物体是由单个细胞构成的，人体大约由不同组织的3.72×1013个细胞组成。微量混合DNA的检验一直都是法医DNA检验的难题。固然通过计算的方法能够对混合DNA图谱拆分解释，但是对于复杂混合图谱，比方一个成分占主要时次要成分的检验，或者3人以上混合图谱的解释就非常困难。细胞分离是一种获得单一个体DNA分型相对直接的方式，低至几个细胞甚至单个细胞的单细胞检验技术也是微量DNA检验的有效途径。以高通量为特点的第二代测序技术nextgenerationsequencing,NGS，能够对几十万条DNA同时测序，实现了快速、高效、低成本的测序。近几年来，单细胞分离技术和二代测序技术结合而产生的单细胞测序single-cellsequencing,SCS技术将为法医DNA检验带来全新的技术手段。1单细胞分离单细胞分离的方法很多，包括显微操作技术micromanipulation、激光捕获显微切割技术lasercapturemicrodissection,LCM、微流控技术microfluidicplatforms等。目前在法医DNA检验中实际应用的技术平台有两种，显微操作技术和激光捕获显微切割技术。1.1细胞染色由于在实际案件中获得的细胞，细胞形态并不是实验室理想的形态，为了更好的识别细胞，在普通显微镜下观察时需要对细胞进行染色。对于上皮细胞，我们研究组尝试了不同的染色方法，通过联用显微操作技术对龙胆紫浓度梯度及时间梯度染色进行研究发现，0.5L龙胆紫染液0.05g/mL参加100L细胞悬液，5min后胞核着色即已明显，能有效提高显微捕获单细胞分离检验技术的检测效能，另外，染色时间不影响DNA结果分析7。对于精子细胞染色，DiMartino等通过比照核固红与巴氏染色法，证明巴氏染色法不仅能明晰的观察精子细胞，而且不影响下游PCR扩增8。Sanders等通过大量的实验发现，苏木素/伊红染色法HE染色后的精子细胞STR分型峰高下降幅度较小，不影响分型结果9。可以以用荧光原位杂交技术对精子细胞的性染色体进行标记。1.2显微操作技术显微操作技术是在显微镜下通过微毛细管汲取单个细胞。典型的显微控制系统包含一个倒置显微镜加上一个操纵杆操作，电动精细控制平台。其优点是操作容易进行，通过显微镜直观地分离单个细胞，成本低，主要用于较小细胞群体中的目的细胞分离。该平台合适对案件中上皮细胞进行分离，3个口腔上皮细胞平行16次试验均可获得完好分型，甚至低至一个细胞可以得到完好分型，该方法已成功应用于一起强奸案的检验。在该案件中，提取受害人皮肤上的唾液斑，通过在镜下分离有核的口腔上皮细胞来自于犯罪嫌疑人和无核角化的上皮细胞或细胞碎片来自于受害者皮肤，成功获得嫌疑人的STR分型。在案件中常碰到的血烟头检材，由于血液量大，常规方法很难获得烟头上唾液来源个体的STR分型，即便用单细胞分离检验时，也经常获得混合STR分型。本课题组在显微操作标准流程的基础上进行改良，将汲取的细胞先在TNE缓冲液中清洗几次，以彻底去除血液细胞碎片和游离DNA，最终获得完好唾液来源个体的DNA分型。也有报道将显微操作分离的方法用于精子分离，但精子细胞体积非常小，直径只要约6m，毛细管汲取操作相对困难，下面介绍的激光捕获显微切割技术平台愈加合适精子细胞的分离操作。显微操作法存在下面几个方面的缺乏。第一，由于依靠手工操作，对实验员的经历与操作能力要求较高，自动化程度较低，而且玻璃吸针脆性大，操作时易碎。第二，耗时较长，操作繁琐。第三，对于涂片后的检材，必须在液体环境下进行操作，容易受蒸发的影响，检材蒸干后，再补水时容易造成检材的损失，甚至带来污染。第四，对于案件中陈旧样本，根据形态识别细胞容易出错。1.3激光捕获显微切割技术激光捕获显微切割技术是利用UV320400nm激光切割并捕获涂于覆膜玻片上的细胞。仪器设备较昂贵，自动化程度较显微操作技术平台高，是目前法医学应用最有效的单细胞分离方法，可用于上皮细胞、精子细胞、白细胞等不同类型的细胞分离。目前，该平台应用较多的是性侵案中差异裂解法无法消除女性成分干扰的精斑检材，通过在显微镜下寻找并捕获精子细胞以消除女性成分。由于精子细胞是单倍体，理论计算证实捕获1520个未降解的精子细胞，有很高的可能性获得完好的STR分型，实验证实至少捕获30个精子细胞可获得完好的STR分型。也有学者应用悬液荧光原位杂交suspensionfluorescenceinsituhybridization，S-FISH对性侵案样本进行标记，通过这种方法能够明显减少前处理操作步骤。对于多个精子奉献者的混合精斑，差异裂解法不能将每个奉献者完全分离。近年来，我们研究组在这方面有深化的研究。通过联合使用激光捕获显微切割方法和低体积扩增技术，能够实现以单个精子细胞DNA为模板，进行Y-STR扩增检测，并成功获得三人混合精斑中各个来源人的Y-STR分型。研究组进一步使用荧光原位杂交技术标记Y型精子，特异性挑选Y型精子，通过优化组合Y-STR基因座与10个常染色体STR基因座auto-STR，构建全新的YA-STR复合系统。其中，Y-STR基因座用于区分不同个体，通过组合Y-STR一样的图谱，实现个体的常染色体STR分型检验。初次尝试将该技术应用于三人混合精斑的检验，准确地获得了三个个体的STR分型。近年来，我们研究组还利用该平台建立了男女混合血液样本的分离检验技术方法。该平台在寻找细胞这一步骤时耗时耗力。有研究组开发了自动化的图像识别软件，通过分析图像中的光强、颜色和形状，可实现快速识别细胞，但是对不同种类细胞准确快速的识别仍需要进一步的研究。1.4微流控技术近期兴起的微流控技术平台因其高通量、自动化、可有效防止污染而备受关注。微流控装置封闭的操作空间能够有效地避免污染，微升至纳升的操作体积能够保证较高的样品浓度，同时减少试剂消耗，固然目前还没有在法医学单细胞分离中实际应用，但将来有很大的发展潜力。2单细胞裂解分离得到单细胞后，需将细胞裂解获得基因组DNA。传统的法医DNA检测需要对基因组DNA进行纯化，而对于单细胞检验，为了避免DNA的损失，常略去纯化步骤，裂解后直接进行PCR扩增。因而，裂解步骤要保证不影响后续PCR扩增反响的顺利进行。目前主要使用蛋白酶裂解，常用蛋白酶K或Protease德国QIAGEN公司，酶解后高温使胞内蛋白质及蛋白酶K变性失活，利于基因组DNA的释放和下游PCR反响。对于精子细胞可参加DTT，打断二硫键，使细胞充分裂解。3PCR扩增一个细胞中的总DNA量仅有数匹克，常规的PCR管扩增需要的细胞数目较多，我们的研究结果显示至少20个口腔上皮细胞或60个精子细胞检测到IdentifilerPCR试剂盒美国ABI公司中全部分型。近期几年发展起来的微量化反响，即芯片-低体积PCR扩增on-chiplowvolume-polymerasechainreaction，LV-PCR系统23,24，在低至1.5L的PCR体系中，DNA模板与引物和聚合酶结合的时机明显提高，使微量细胞甚至单个细胞进行DNA分型变为现实，不仅检测的灵敏度得到提高，而且检验范围也大大拓宽了。LV-PCR使用贝克曼公司的AG480FAmpliGridslide进行扩增，前期大量的研究都是使用该产品进行，而且实验证实该产品灵敏度、准确性可知足法医单细胞检验的要求。另外一种最新的方法也值得关注，是在微液滴里进行PCR扩增。首先将单个细胞和荧光标记引物结合的微珠随机扩散在1.5nL的油包裹的琼脂微流液滴中，在大量微液滴内进行平行的PCR扩增反响后，于PCR扩增管内进行二次扩增，常规毛细管电泳检测，通过对大量单个细胞进行平行9重STR检测，获得混合样本各成分的STR分型。4数据分析单细胞检验由于DNA模板量非常低，其缺带、多带等现象经常发生，stutter峰较常规扩加强，单细胞检验的数据分析和低拷贝DNA的分析方法类似，需平行扩增，综合屡次结果获得最终的STR分型。一般来讲至少需获得5次有效分型获得13个基因座以上的结果28，重复3次及以上的位点才能确以为有效位点。5单细胞测序在二代测序技术和全基因组扩增技术wholegenomeamplification,WGA发展的基础上，2011年，Navin等人初次发明了单细胞测序single-cellsequencing,SCS技术，测定了人体单个细胞的基因组DNA。单细胞测序的文章呈逐年递增状态，从20112014年，由5篇文章上升至近30篇，涉及生物学多个领域，发表于生物学顶级期刊上。2013年（，科学）杂志将单细胞测序列为年度领域榜首（，自然方法）杂志将单细胞测序列为2013年年度最重要的方法学进展。5.1全基因组扩增技术由于单个细胞DNA含量有限，需进行全基因组扩增才能知足二代测序的最低DNA量。目前，已有多种以单个基因组为模板的全基因扩增技术，简称寡核苷酸引物PCR技术degenerateoligonucleotideprimedPCR,DOP-PCR和多重置换扩增技术multipledisplacementamplification,MDA。其中DOP-PCR方法覆盖率低，但可获得准确的拷贝数。MDA方法是在恒温下利用具有强模板结合的phi29DNA聚合酶和六聚物进行链置换扩增反响。Phi29DNA聚合酶具有35外切酶活性，并且具有特殊的多重置换和连续合成特性，产生的DN段较大，约为50100kb，能够覆盖基因组的90%以上，和DOP-PCR方法一样也会产生不同区域扩增不平衡性，MDA方法产生的不平衡性不具有重复性。2012年，初次报道了基于屡次退火环状循环的扩增技术multipleannealingandlooping-basedamplificationcycles,MALBAC，该方法结合MDA扩增技术和PCR扩增技术的优势，利用特殊设计的引物，巧妙地使扩增子的结尾通过互补而成环，进而在一定程度上防止了基因组DNA的指数性扩增，明显降低了扩增偏倚性，并显著提高覆盖度，但是该方法使用Bst聚合酶，没有校错活性proofreadingactivity。现有的商业化试剂盒各项参数见表1。全基因组扩增技术固然仍然会有基因缺失等问题，但是相信随着时间的推移和技术的进步，扩增的准确性会逐步提高。5.2二代测序技术对单细胞全基因组扩增后进行二代测序。二代测序技术具有快速、高效、低成本的优点。近两年来的研究表明，二代测序结果的准确性很高，与传统的Sanger测序相当。二代测序技术在法医学中应用研究很多，目前已经有两种商业化的试剂盒，美国ThermoFisherScientific公司开发的基于SNP的theHID-IonAmpliSeqTMIdentityPanel和theHID-IonAmpliSeqTMAncestryPanel，主要通过SNP检测进行个体识别和祖先推断；美国Illumina公司开发的ForenSeqTMDNASignaturePrepKit，在一个PCR反响中能够同时扩增27个常染色体STR，8个X-STR，25个Y-STR，95个个体识别SNPs，56个祖先信息标记(ancestryinformativemarkers,AIMs)和24个显性特征SNPs，更合适法医学应用。这两个公司使用的测序技术的优缺点见表2。6单细胞检验瞻望目前单细胞测序尚未应用到法医学领域中，但是具有很好的应用前景，是单细胞检验将来发展的重要方向。单细胞全基因组扩增后，利用二代测序大量平行测序的特点，对几百个甚至几千个细胞进行平行测序，相当于对一个样本进行数百次检测，通过重复测定可部分克制全基因组扩增带来的基因缺失的缺乏。再者，该技术能够检测混合样本中次要成分的STR分型或者三人及以上混合样本，一次获得不同个体的STR、SNP等多种遗传标记。目前，单细胞测序成本偏高，需进一步研发多重单细胞DNA测序平台，能够以较低的成本平行检测数百个细胞，另外，作为第三代测序技术的单分子实时测序可直接“读取DNA序列，也是将来发展方向之一。总之，微量混合生物样本的检验一直是制约DNA检验技术发挥作用的瓶颈，传统的单细胞检验技术因其高灵敏度、可特异性挑选细胞的优势已经应用到实际案件中微量混合生物样本的检验，而单细胞测序技术结合了二代测序技术大规模平行检测的特点，将为微量混合生物样品检验提供一种全新的技术手段。