222动物细胞融合与单克隆抗体.ppt

2.2.22.2.2动物细胞融合与单克隆抗体动物细胞融合与单克隆抗体一、动物细胞融合一、动物细胞融合 细胞融合是正常的生命活动细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合两个细胞正在融合 受精作用受精作用概念：概念： 动物细胞融合也称动物细胞融合也称细胞杂交细胞杂交，是指两个或，是指两个或多个动物细胞形成多个动物细胞形成一个细胞一个细胞的过程。的过程。一、动物细胞融合一、动物细胞融合诱导方式诱导方式物理法物理法化学法化学法生物法：生物法：灭活的病毒灭活的病毒灭活的仙台病毒灭活的仙台病毒丧失感染性丧失感染性（不感染细胞）（不感染细胞）保留融合活性保留融合活性（诱导细胞融合）（诱导细胞融合）方法：方法：动物动物细胞细胞融合融合过程过程: :不同不同DNADNA的两个细胞的两个细胞灭活病毒诱导细胞融合灭活病毒诱导细胞融合融合后的细胞进行有丝分裂融合后的细胞进行有丝分裂动物细胞融合过程动物细胞融合过程原理：原理： 细胞膜的流动性细胞膜的流动性植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目比较项目植物体细胞杂交植物体细胞杂交动物细胞融合动物细胞融合细胞融合原理细胞融合原理细胞膜的流动性、细胞膜的流动性、植物细胞全能性植物细胞全能性细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞融合的方法细胞融合的方法 去除细胞壁后诱导去除细胞壁后诱导原生质体融合原生质体融合使细胞分散后诱使细胞分散后诱导细胞融合导细胞融合诱导方法诱导方法物理（离心、振荡、物理（离心、振荡、电刺激）电刺激）化学（聚乙二醇）化学（聚乙二醇）物理、化学方法物理、化学方法（同左）（同左）灭活的病毒灭活的病毒用途用途获得杂种植株获得杂种植株制备单克隆抗体制备单克隆抗体二、单克隆抗体二、单克隆抗体什么是抗体？什么是抗体？ 抗体是机体受抗原刺激后产生的、抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。免疫功能的球蛋白。浆细胞产生抗体。浆细胞产生抗体。 抗原抗原刺激刺激浆细胞浆细胞 抗体抗体特异性差、纯度低；产量低、反应不够灵敏特异性差、纯度低；产量低、反应不够灵敏传统血清抗体的制备途径：传统血清抗体的制备途径：二、单克隆抗体二、单克隆抗体动物体动物体传统血清抗体的制备的缺陷：传统血清抗体的制备的缺陷：如何大量生产单克隆抗体？如何大量生产单克隆抗体？ 利用淋巴细胞产生抗体的功能利用淋巴细胞产生抗体的功能 利用肿瘤细胞无限增殖的特性利用肿瘤细胞无限增殖的特性 利用细胞融合的技术将两种细胞融利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞性的杂交瘤细胞 利用动物细胞培养技术大量培养杂利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞交瘤细胞科勒科勒米尔斯坦米尔斯坦荣获荣获19841984年诺贝尔生理学或医学奖年诺贝尔生理学或医学奖一个一个B B淋巴细胞只分泌淋巴细胞只分泌一种特异性抗体一种特异性抗体小鼠骨髓瘤细胞能小鼠骨髓瘤细胞能无限增殖无限增殖杂种杂种细胞细胞二、单克隆抗体二、单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体 由由单个单个B B淋巴细胞淋巴细胞经过经过无性繁殖无性繁殖（克隆克隆），），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的所产生的化学性质单一、特异性强的抗体化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。称为单克隆抗体。 特点：特点：特异性强、灵敏度高特异性强、灵敏度高 1. 1. 细胞两两融合后，有哪些类型？细胞两两融合后，有哪些类型？B-B B-B B-B-瘤瘤( (杂交瘤细胞杂交瘤细胞) ) 瘤瘤- -瘤瘤 2 2、如何筛选？、如何筛选？ （1 1）淋巴细胞合成）淋巴细胞合成DNADNA有有D D和和S S两条两条途径，其中途径，其中DD途径能够被途径能够被氨基蝶呤阻断氨基蝶呤阻断。但是一般不分裂增殖。但是一般不分裂增殖。（2 2）骨髓瘤细胞是特殊选择的代谢缺）骨髓瘤细胞是特殊选择的代谢缺陷型细胞陷型细胞，其其DNADNA合成过程只具有合成过程只具有D D途径，能被途径，能被氨基蝶呤阻断氨基蝶呤阻断。（3 3）杂交瘤细胞则既可无限增殖，又）杂交瘤细胞则既可无限增殖，又具备两条具备两条DNADNA合成途径。合成途径。资料：资料： 单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程 注射抗原注射抗原B B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选细胞融合、筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养细胞培养筛选，继续培养筛选，继续培养足够数量的、能产生足够数量的、能产生特定抗体的细胞群特定抗体的细胞群体外培养体外培养注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔单克隆抗体单克隆抗体思考：思考：1 1、本过程利用了哪些原理？、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理2 2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B B细胞融合？细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有亲细胞的遗传物质，不仅具有B B细胞分细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体本领，因而可以获得大量单克隆抗体单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，灵敏度高特异性强，灵敏度高，优越性十分明显。，优越性十分明显。应用主要有：应用主要有：1 1、临床诊断、临床诊断2 2、作为载体，运载抗癌药物，形成、作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹生物导弹”治疗肿治疗肿瘤瘤资料资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内体内“病灶病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。及心肌梗塞的诊断。 小结小结两个过程两个过程动物细胞培养过程动物细胞培养过程单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程三个三个“一一”一个诱导细胞融合的新方法一个诱导细胞融合的新方法 灭活病毒灭活病毒一个新细胞杂交瘤细胞一个新细胞杂交瘤细胞一个优势单克隆抗体特异性一个优势单克隆抗体特异性 强、灵敏度高的优势强、灵敏度高的优势植物体细胞杂交植物体细胞杂交动物细胞融合动物细胞融合( (单克隆抗体制备单克隆抗体制备) )过过程程第第一一步步原生质体的原生质体的制备制备( (酶解酶解法法) )正常小鼠正常小鼠免疫处理免疫处理第第二二步步原生质体融原生质体融合合( (物、化物、化法法) )动物细胞动物细胞融合融合第第三三步步杂种细胞的杂种细胞的筛选与培养筛选与培养杂交瘤细杂交瘤细胞的筛选胞的筛选与培养与培养第第四四步步杂种植株诱杂种植株诱导与鉴定导与鉴定单克隆抗单克隆抗体的提纯体的提纯意义意义和和用途用途克服远缘杂交克服远缘杂交不亲和的障碍，不亲和的障碍，大大扩展了可用大大扩展了可用于杂交的亲本组于杂交的亲本组合范围合范围突破有性杂交突破有性杂交的母系遗传，获的母系遗传，获得细胞质基因的得细胞质基因的杂合子，研究细杂合子，研究细胞质遗传胞质遗传制备单克隆抗体制备单克隆抗体诊断、治疗和预防疾诊断、治疗和预防疾病，例如：病，例如：a a肿瘤定位诊断，放射肿瘤定位诊断，放射性抗体性抗体肿瘤肿瘤b b生物导弹治疗，抗体生物导弹治疗，抗体抗癌药物抗癌药物肿瘤肿瘤练习：练习：1 1在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是（）确的是（）A A结果是相同的结果是相同的B B杂种细胞的形成过程基本相同杂种细胞的形成过程基本相同C C操作过程中酶的作用相同操作过程中酶的作用相同DD诱导融合的手段相同诱导融合的手段相同2. 2. 单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B B淋巴细胞淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（ ） 淋巴细胞淋巴细胞小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞B B淋巴细胞自身融合细胞淋巴细胞自身融合细胞小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞A A B BC C DD C3 3下列关于单克隆抗体制备过程的叙下列关于单克隆抗体制备过程的叙述，正确的是述，正确的是 ( () )A A制备过程中不需要动物细胞培养技制备过程中不需要动物细胞培养技术术B B杂交瘤细胞具有浆细胞与癌细胞的杂交瘤细胞具有浆细胞与癌细胞的所有特点所有特点C C经选择性培养基筛选出来的杂交瘤经选择性培养基筛选出来的杂交瘤细胞即可用于单克隆抗体的生产细胞即可用于单克隆抗体的生产D D单克隆抗体最广泛的用途是用作体单克隆抗体最广泛的用途是用作体外诊断试剂外诊断试剂D 4. 4. 下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的实验方案破伤风杆菌的实验方案2 2、该方案能达到预期效果吗？为什么？、该方案能达到预期效果吗？为什么？4 4、图中、图中B B为为_过程，常用过程，常用_作为诱导剂，该细胞继作为诱导剂，该细胞继承承_的遗传特性，既能的遗传特性，既能_,_,又能又能_。1 1、该实验方案的目的是、该实验方案的目的是_3 3、A A是从小鼠的脾脏中取得是从小鼠的脾脏中取得_,_,该细胞能够产生该细胞能够产生_5 5、C C过程指细胞培养，该过程包括过程指细胞培养，该过程包括_培养和培养和_培养两个阶段，其培养两个阶段，其中中_代以内的的细胞属于细胞株。代以内的的细胞属于细胞株。制备单克隆抗体制备单克隆抗体B B细胞细胞抗体抗体细胞融合细胞融合灭活病毒灭活病毒双亲细胞双亲细胞分泌抗体分泌抗体无限增殖无限增殖原代原代传代传代5050B体外培养体外培养骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群足够数量的细胞群注射到注射到小鼠腹腔小鼠腹腔AC5.5.已知细胞合成已知细胞合成DNADNA有有D D和和S S两条途径，两条途径，其中其中DD途径能被氨基嘌呤阻断。人淋途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两种巴细胞中有这两种DNADNA的合成途径，的合成途径，但一般不分裂增殖。但一般不分裂增殖。 鼠骨髓瘤细胞鼠骨髓瘤细胞中尽管没有中尽管没有S S途径，但能不断分裂增途径，但能不断分裂增殖。将这两种细胞在试管中混合，加殖。将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞。请回聚乙二醇促融，获得杂种细胞。请回答：答：（1 1）试管中除融合的杂种细胞外，还）试管中除融合的杂种细胞外，还有有_种融合细胞。种融合细胞。2（2 2）设计一方法（不考虑机械方）设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出杂种细胞，法），从培养液中分离出杂种细胞，并说明原理：并说明原理：方法：方法：_ _培养液中加入氨基嘌呤，培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞收集增殖的细胞 原理：原理： 加入氨基嘌呤后，使加入氨基嘌呤后，使D D合成途径合成途径阻断，仅有阻断，仅有DD全合成途径的骨髓全合成途径的骨髓细胞及其彼此融合的细胞就不能细胞及其彼此融合的细胞就不能增殖，但人淋巴细胞增殖，但人淋巴细胞 和骨髓癌和骨髓癌细胞融合后的杂种细胞中可以利细胞融合后的杂种细胞中可以利用淋巴细胞中的用淋巴细胞中的S S途径合成途径合成DNADNA而增殖。而增殖。