白血病抑制因子对牙膜细胞成骨影响-精品文档.docx

白血病抑制因子对牙膜细胞成骨影响摘要目的:探究白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor，LIF)对人牙周膜细胞(humanperiodontalligamentcells，HPDLCs)成骨分化能力的影响。方法:分离培养HPDLCs，分别为空白对照组、标准骨诱导组和参加重组人白血病抑制因子(recombinanthumanleukemiainhibitoryfactor，rhLIF)的骨诱导组。7d后碱性磷酸酶(alkalinephos-phatase，ALP)染色及活性检测，21d后矿化结节染色和定量分析，实时荧光定量PC(qT-PC)检测第5dHPDLCs中成骨相关基因ALP、骨涎蛋白(bonesialoprotein，BSP)和骨钙蛋白(osteocalcin，OCN)的mNA表达量。结果:7d后，标准骨诱导组ALP染色呈深蓝色，LIF刺激后，染色明显变浅，活性显著下降(P0.01)。21d后，标准组HPDLC有大量矿化结节构成，而LIF组明显减少(P0.05)，qT-PC结果显示标准组ALP、BSP和OCN的表达显著提高(P0.01)，而LIF刺激后，表达明显降低(P0.01)。结论:LIF可抑制HPDLC的成骨向分化。关键词白血病抑制因子;牙周膜细胞;成骨牙周膜细胞(periodontalligamentcells，PDLC)是一组具有异型性的细胞群，包含具有分化潜能的牙周干细胞，可分化为成骨细胞、成牙骨质细胞、成纤维细胞等1。PDLC的成骨向分化后，具有成骨细胞的表型和特性2。因此，PDLC在牙槽骨的改建中扮演重要角色，PDLC成骨向分化是牙槽骨改建的前提之一。白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor，LIF)属于IL-6细胞因子家族中的一员，是一种多功能的细胞因子，其广泛存在于成纤维细胞、上皮细胞、胚胎干细胞、骨髓基质细胞、成骨细胞和破骨细胞之中。近年来的研究发现，LIF能调节骨代谢，既介入了骨构成经过3，4，又介入了骨吸收经过5，6，在调节骨组织改建中发挥重要作用。因而，LIF能否在PDLC成骨向分化中发挥作用，进而介入牙周组织改建。本实验将利用体外培养人牙周膜细胞(humanperiodontalligamentcells，HPDLCs)模型，观察LIF对HPDLC成骨向分化的影响，初步讨论其在牙周组织改建和再生中可能的作用。材料和方法1HPDLC的分离培养与鉴定选取1014岁儿童因正畸需要而铲除的健康前磨牙，取牙周组织块进行贴壁培养。从第4d开场，每3d换液1次。同时，倒置荧光显微镜下观察，当组织块边缘游出的细胞增加且密集到一定程度时，进行传代，选用第35代培养的细胞用于实验。本实验经深圳市盐田区人民医院医学伦理委员会批准。形态学鉴定:倒置显微镜下观察细胞由组织块边缘游出的情况，观察细胞形态及传代后细胞生长状况。免疫学鉴定:取生长状态良好的第4代HPDLCs接种于置有盖玻片的6孔培养板中，待细胞长至80%时取出玻片，4%多聚甲醛固定，用免疫组化SP法进行波形丝蛋白和细胞角蛋白染色。2LIF对HPDLC成骨向分化的影响2.1矿化诱导取第3代HPDLCs，用胰蛋白酶消化后，以5×104个/mL的浓度接种于24孔板中，每孔液量为1mL。分别为空白对照组、标准骨诱导组和参加重组人白血病抑制因子(recombinanthumanleukemiainhibitoryfactor，rhLIF)的骨诱导组，每3d换液1次。2.2碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)染色矿化诱导液培养7d后PBS液冲洗，用70%乙醇固定1h，PBS冲洗3遍。然后用ALP染色试剂盒避光染色30min后，用双蒸水冲洗，终止反响。2.3ALP活性检测三组细胞均培养7d后用PBS清洗，然后用1%TritonX-100裂解细胞。采用PNPP法进行测定，用PNP做标准曲线，计算ALP活性，溶胞产物中蛋白含量用BCA蛋白测试盒测定。2.4矿化结节染色及定量分析培养21d后，PBS冲洗，用70%乙醇固定1h。然后进行茜素红染色及定量分析。2.5实时荧光定量PC(qT-PC)检测培养5d后，用Trizol提取总NA，逆转录合成cDNA，引物序列如表1。用SYBGreenKit检测ALP、BSP和OCN的表达。1免疫学鉴定所培养的细胞经SP免疫细胞化学检测呈抗波形丝蛋白阳性，抗角蛋白阴性，符合成纤维样细胞的特征。证实细胞来源于中胚层，且无上皮源性细胞混杂，阴性对照组均未见阳性染色结果(图1)。2LIF对HPDLC成骨向分化的影响2.1LIF抑制HPDLC的ALP活性矿化诱导7d后，ALP染色呈深蓝色，而参加外源性LIF刺激后，染色明显变浅(图2A)。从ALP活性检测中可看出，矿化诱导7d后，HPDLC的ALP活性比对照组明显加强，但参加外源性LIF刺激后，ALP活性显著下降(图2B)。2.2LIF抑制HPDLC的矿化结节构成茜素红染色后可见，矿化诱导后HPDLC有大量矿化结节构成，而参加LIF处理的HPDLC中少有矿化结节构成。其qT-PC定量分析显示，LIF处理过的HPDLC矿化诱导后的吸光光度值显著低于未经LIF处理的阳性对照组(P0.05)，讲明LIF显著抑制了HPDLC的矿化(图3)。2.3LIF抑制HPDLC的成骨相关基因的表达矿化诱导后ALP、BSP和OCN的表达比对照组有显著提高(P0.01)，但外源性LIF刺激后，ALP、BSP和OCN的表达却明显降低(P0.01)(图4)。本研究中，LIF作用后，HPDLC的成骨向分化水平显著降低，提示LIF抑制了HPDLC的成骨向分化。且LIF降低HPDLC活性的结果和LIF可降低MC3T3-E1细胞中ALP活性和型胶原mNA的表达6相一致。而LIF抑制HPDLC矿化结节的构成及ALP、BSP和OCN基因的表达的结果，与Malaval等4的研究结果相一致:在从出生21d的大鼠颅盖骨中分离培养的细胞的骨向分化经过中，LIF剂量依靠性的抑制矿化结节的构成;同时，LIF降低了ALPmNA的表达和活性，且明显抑制BSP和OCN的表达。然而，也有实验表明，LIF能够直接刺激成骨细胞的增殖、分化，以及诱导ALP的表达7。与本实验结果相差异，是由于所选用的细胞来自不同的细胞体系，来自不同的个体。也有可能与细胞性质不同，或实验用细胞的差异相关，如细胞来自生长期的不同阶段、取材的部位不一致、或固有的分化能力就有所不同。LIF本身这种促骨构成的矛盾提示，LIF对骨祖细胞的分化增殖以及骨构成的作用非常复杂。与特定的细胞分化阶段有关。跟骨祖细胞所处的分化阶段不同、细胞培养所处的环境不一样及细胞系来源的不同，受体转化机制有关。Malaval等4研究发现，白血病抑制因子受体(leukemiainhibitoryfactorreceptor，LIF)和致癌蛋白M受体(oncostatinMreceptor，OSM)在骨祖细胞的表型和分化中起着不同的作用，极有可能是通过不同的信号转导通路。Falco-ni等8研究证明成骨细胞的分化与透明质酸(haluron-icacid，HA)的表达水平密切相关，LIF通过刺激透明质酸合成酶2(hyaluronansynthase2，HAS2)，来合成高分子量的HA，进而抑制成骨细胞的生长。而PDLC作为牙周组织中的优势细胞，可通过增殖和分化9，介入牙周膜和牙槽骨的改建。LIF作为IL-6家族的主要成员，可由机体很多组织诱导产生并具有广泛的生物学活动。IL-6、LIF、OSM这些IL-6家族中的细胞因子，可刺激破骨细胞的构成并调节其功能，有学者10发现IL-6家族的细胞因子能通过gp130和上调STAT转录因子的活性来刺激基质细胞与成骨细胞中ANKL的表达。在以往证实PDLC可表达成骨细胞特征的基础上，Kanzaki等11从基因和蛋白水平证实了PDLC表达OPG和ANKL，并遭到1，25(OH)2维生素D3的调节12。OPG和ANKL是由成骨细胞产生的直接控制破骨细胞生成的功能因子。目前以为成骨细胞通过OPG和ANKL影响破骨细胞的生成13，14。因而，当发生牙周炎或受外界环境刺激时，PDLC分泌产生的LIF可能促进成骨样PDLC分泌大量的ANKL，而ANKL识别破骨前体细胞上的ANK，使破骨细胞分化成熟而引起骨吸收进而抑制HPDLC成骨向分化。本课题组前期实验表明，LIF通过JAK2/STAT3信号通路抑制牙髓细胞向成牙本质样细胞的分化15，其可能的机理是IL-6家族(和LIF同家族)可激活人乳腺癌细胞中STAT3的活性和Twist的表达16，而Twist是一个强的成骨细胞分化的抑制子，Twist-1基因敲除小鼠身上ALP活性增加、I型胶原和DSPP表达显著增高、早期牙本质基质的构成和髓腔中髓石的构成明显增加17。因而，LIF也有可能通过这条机理抑制PDLC的矿化。另一方面也有可能与LIF的保持细胞多功能分化潜能和允许其自我更新的特性有关。LIF在人骨髓基质干细胞中也对干细胞的分化有负调节作用，在未分化的骨髓基质细胞中LIF有更高水平的表达。且在本课题组的相关实验中发现，在HPDLC传代培养经过中，外源性LIF刺激下的HPDLC中Stro-1和CD146这两个干细胞标记的阳性表达率比正常HPDLC高。讲明LIF对HPDLC的多分化具有负调节作用。而HPDLC和骨髓基质细胞、牙髓细胞及胚胎干细胞一样具有自我更新和维持多分化潜能的能力。因而，LIF对HPDLC骨向分化的抑制作用可能跟LIF保持HPDLC多功能分化潜能和允许其自我更新的特性有关。