基因工程的工具.ppt

一、DNA重组技术的基本工具425，3， 特别提醒特别提醒 获取目的基因和切割载体时使用同种限制酶，目的是获取目的基因和切割载体时使用同种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。产生相同的黏性末端。获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生4 4个黏性末个黏性末端或平末端。端或平末端。限制酶切割位点的选择必须保证标记基因的完整性，以限制酶切割位点的选择必须保证标记基因的完整性，以便于检测。便于检测。例、图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有Msp 、BamH 、Mbo 、Sma 4种限制性核酸内切酶切割的碱基序列和酶切位点分别为CCGG、GGATCC、GATC、CCCGGG。请回答下列问题：1 1）图）图1 1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由由 _（基团）连接。（基团）连接。（2 2）若用限制酶）若用限制酶Sma Sma 完全切割图完全切割图1 1中中DNADNA片段，产片段，产生的末端是生的末端是 末端，其产物长度为末端，其产物长度为 。537bp537bp、790bp790bp、661bp661bp脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖平平 Msp、 BamH、 Mbo、SmaCCGG、GGATCC、GATC、 CCCGGG。（3 3）若图）若图1 1中虚线方框内的碱基对被中虚线方框内的碱基对被T TA A碱基对替换，那碱基对替换，那么基因么基因D D就突变为基因就突变为基因d d。从杂合子分离出图。从杂合子分离出图1 1及其对应的及其对应的DNADNA片段，用限制酶片段，用限制酶SmaSma完全切割，产物中共有完全切割，产物中共有_ 种不同种不同DNADNA片段。片段。4 4 Msp、 BamH、 Mbo、SmaCCGG、GGATCC、GATC、 CCCGGG。（4 4）若将图）若将图2 2中质粒和目的基因中质粒和目的基因D D通过同种限制酶处理后通过同种限制酶处理后进行，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是进行，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是 。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加一般需要用添加 的培养基进行培养。经检测，的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D D不能正确不能正确表达，其最可能的原因是表达，其最可能的原因是_。 同种限制酶切割形成的末端相同，同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因部分目的基因D D与质粒反向连接与质粒反向连接BamH IBamH I Msp、 BamH、 Mbo、SmaCCGG、GGATCC、GATC、 CCCGGG。 抗生素抗生素B B（1 1）假设图中质粒原来）假设图中质粒原来BamH IBamH I的识别序列变为的识别序列变为Bcl IBcl I的的识别序列，现用识别序列，现用Bcl IBcl I和和HindHind切割质粒，再经过程切割质粒，再经过程能否获得所需重组质粒能否获得所需重组质粒? ? ，理由，理由是是 。（2 2）若上述假设成立，并成功形成重组质粒，则重组）若上述假设成立，并成功形成重组质粒，则重组质粒可被限制酶质粒可被限制酶 切割。切割。切割后露出的黏性末端相同切割后露出的黏性末端相同能能HindHind