芸香草的体外抗氧化活性研究.docx

芸香草的体外抗氧化活性研究（安徽农业科学杂志）2014年第二十五期1芸香草中多酚的抗氧化活性的测定11复原力的测定8。移取浓度为05mg/ml的芸香草不同极性提取液04ml，稀释至10ml，加25ml磷酸盐缓冲液PBS(02mol/L，pH66)摇均，再参加1%铁氰化钾25ml摇均，置于50水浴恒温反响20min，加10%三氯乙酸溶液1ml，摇均，3000r/min离心5min;取上清液25ml，加水25ml稀释，再参加01%三氯化铁05ml，避光反响10min后在波长760nm处测定吸光度。每个样重复测定3次，取平均值。同时在一样条件下测定抗坏血酸(VC)的复原力。12DPPH自由基去除能力的测定9。移取适当浓度的芸香草不同极性提取液各20ml于具塞试管中，参加0010mg/ml的DPPH乙醇溶液20ml，混合均匀，静置30min后倒入1cm的比色皿中，在517nm处测定其吸光度值，同时测定样品空白以及不加样空白的吸光度值。每个样重复测定3次，取平均值。同时一样条件下测定抗坏血酸(VC)对DPPH自由基去除能力。13羟基自由基去除率的测定10。向25ml容量瓶中依次参加75mmol/ml邻二氮菲溶液10ml、PBS(pH=74)50ml、75mmol/mlFeSO4溶液10ml，一定量的抗氧化剂溶液(损伤管及未损伤不加提取液)、体积分数为01%双氧水10ml(未损伤管不加)，以蒸馏水定容，暗处放置60min，在510nm处测定吸光度。以上每加一次试剂需摇均。每个样重复测定3次，取平均值。同时以抗坏血酸(VC)作为对照物。羟自由基去除率计算公式为:羟自由基的去除率。14超氧阴离子自由基的去除率的测定11。取50mmol/L的45mlTris-HCI缓冲溶液(pH=82)，42ml蒸馏水混匀后在25预热过的3mmol/L邻苯三酚03ml，迅速摇匀后倒入比测皿，420nm下每隔30s测定吸光度，总4min。以10mmol/LHCI溶液配制空白管作为对照。根据上述步骤在参加邻苯三酚前先分别参加10ml芸香草不同溶剂提取液，蒸馏水减少。同样以10mmol/LHCI溶液配制空白管作为对照。同时在一样条件下测定抗坏血酸(VC)对超氧阴离子的去除能力，测定吸光度。超氧阴离子自由基的去除率的测定计算公式为:超氧阴离子自由基的去除率。2结果与分析21没食子酸对照品的标准曲线的绘制按“1321项的试验方法，在760nm波长处测定标准品系列溶液的吸光度，以没食子酸含量(g/ml)为横坐标、相应吸光度为纵坐标进行线性回归，得到食子酸的标准曲线(图2)，其回归方程为y=00090x+00183(2=09963)。从图2可看出，在084g/ml有良好的线性关系。22芸香草不同极性溶剂提取液中多酚含量总多酚含量以Folin-Ciocalteu法测定，结果根据标准曲线计算，所得结果表明，70%乙醇作为溶剂的粗提取液的多酚含量最多，乙酸乙酯相的多酚含量最小，其顺序为70%乙醇(387mg/g)蒸馏水(157mg/g)正丁醇(083mg/g)氯仿(052mg/g)乙酸乙酯(041mg/g)，溶剂极性越强，总酚含量越高。根据类似相溶原理可知芸香草多酚以极性酚为主，极性酚含量显著高于弱极性酚含量。23芸香草多酚抗氧化活性的研究231芸香草不同极性提取物的复原力。复原力的测定以样品能否为电子供体为指标，供给的电子除了可使Fe3+复原为Fe2+外，亦可与自由基反响，使自由基成为较稳定的物质。根据测得的吸光度值能够测定样品复原能力的大小12。吸光度值越大，表明抗氧化剂对Fe3+复原能力越强。从图3能够看出，芸香草不同极性提取物均有一定的复原力，在一样浓度下复原力最大的是抗坏血酸(VC)，其次是70%的乙醇提取液，复原力最小的是乙酸乙酯提取液，其复原力相当于VC的1/3。232芸香草不同极性提取物对DPPH自由基去除能力。DPPH为一相当稳定的自由基，其甲醇溶液在517nm附近有强的吸光值，当被抗氧化剂复原，或与另外一个自由基结合时，吸光值均会降低，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系13。在DPPH溶液中参加自由基去除剂时，溶液颜色变浅，最大吸收峰处的吸光度变小，而吸光度变小的程度与自由基被去除的程度呈线性关系。因而，可用自由基的去除情况来评价某物的抗氧化能力。其抗氧化能力用去除率表示，去除率越大，抗氧化能力越强。采用“1332节的方法测定不同极性芸香草多酚对DPPH自由基的去除作用，结果表明(图4)，芸香草不同极性提取液对DPPH均有一定的去除能力，且均具有明显的量效关系。提取物中多酚浓度均为0100mg/ml时，70%乙醇、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水提取液和VC等对DPPH的去除率分别为9555%、5591%、8080%、8178%、9415%和9972%，70%乙醇和水提取液对DPPH有较强的去除作用，其去除率与VC的相近。233芸香草不同极性提取物对羟基自由基的去除能力。羟自由基(OH)是一种氧化能力很强的自由基，它能够很容易地氧化各种有机物和无机物，氧化效率高，反响速率快，是造成组织脂质过氧化、核酸断裂、蛋白质和多糖分解的活性氧，与机体的衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬有关。通过Fenton反响所产生的OH，可使邻二氮菲Fe2+水溶液氧化为邻二氮菲Fe3+，进而使邻二氮菲Fe3+在510nm处的最大吸收峰消失，据此可推知系统中OH的量的变化14。采用Fenton法测定了芸香草不同极性提取液对OH的去除作用，结果表明(图5)，各提取液对OH均有一定的去除作用，它们的多酚浓度一样(0100g/ml)时，各提取液对羟自由基的去除率的大小为VC水70%乙醇正丁醇氯仿乙酸乙酯。234芸香草不同极性提取物对超氧阴离子自由基的去除能力。邻苯三酚在碱性条件下发生自氧化释放氧阴离子自由基(O2)，并生成有色中间产物，该有色中间产物在420nm波长处有一特征吸收峰，当有抑制剂存在时，可去除O2，进而阻止中间产物的积累，可通过比色法来检测有色中间产物的含量，以检测物质去除O2的能力15。该试验利用这一特点，测定不同时间反响体系的吸光度，测得邻苯三酚自氧化速率和参加不同极性提取液后邻苯三酚自氧化速率，间接测定各提取液对O2的抑制率。从图6能够看出，芸香草不同极性提取液对超氧阴离子有一定的去除能力，各提取液多酚浓度一样(0100g/ml)时，对O2去除能力从大到小的顺序为70%乙醇VC水正丁醇氯仿乙酸乙酯，其中70%乙醇对O2去除能力与VC相当，而乙酸乙酯提取物对O2去除能力是VC的1/4。图6芸香草不同极性提取物对O2的去除力。3讨论多酚是植物原料的一种重要次生代谢产物，是绝大多数植物性食品和药材的活性成分。使用不同极性溶剂能够提取不同极性(即种类)的酚类化合物，它们在构造和性质上有所不同。该试验用70%乙醇、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水等溶剂超声提取了芸香草中多酚，被提取的多酚含量顺序为70%乙醇水正丁醇氯仿乙酸乙酯。溶剂极性越强，总酚含量越高，根据类似相溶原理可知芸香草多酚以极性酚为主，极性酚显著高于弱极性酚含量。芸香草提取物对DP-PH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基的去除率和复原力的大小也与溶剂极性密切相关，总的来讲，极性越强的多酚，其抗氧化活性也越强。为了更准确地表征芸香草抗氧化作用机理，有必要对提取物中多酚单体组分进行分离、纯化和构造鉴定。