食源性致病菌的多重PCR检测.docx

食源性致病菌的多重PCR检测（生物技术通报杂志）2014年第七期1材料与方法1.1材料菌种名称及编号，见表1。1.2方法1.2.1引物的设计与合成根据沙门菌的hilA基因、金黄色葡萄球菌的nuc基因和肠出血性大肠杆菌O157H7的rfbE基因，应用PrimerPremier5.0分别设计如下3对特异性引物表2，并送至生工生物上海有限公司合成。1.2.2食源性致病菌的培养和基因组DNA的提取从保藏斜面中挑取适宜的菌落置于LB液体培养基中，37恒温培养24h后，再以140的比例转接至新的LB培养液中37恒温培养24h进行活化。最后以140的比例移接至新的LB培养液中37恒温振荡培养2-4h，至菌液OD600为0.7-1.0，用细菌DNA提取试剂盒分别提取3种菌的DNA，-20保存备用。1.2.3单重PCR反响体系的建立单重PCR反响体系50L：Taq酶0.25L，10×PCRBuffer5L，dNTPMixture4L，模板DNA溶液3L，引物20mol/L各1L，加去离子水至50L。PCR参数：94预变性5min；94变性40s，50退火1min，72延伸2min，30个循环；72延伸7min。4保存。1.2.4多重PCR反响体系的建立及优化将以上3对引物进行两两组合或三者混合，混合3种致病菌的基因组DNA作为模板进行PCR反响，验证多重PCR反响的特异性及引物之间的互相作用。调整反响体系中的引物浓度和模板浓度等，优化多重PCR反响体系，反响程序同1.2.3。1.2.5人工模拟样品的PCR检测分别制备沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌O157H7和金黄色葡萄球菌的菌悬液，将3种培养液单独接种鲜奶培养24h，或任意两两等量混合然后取少量接种到鲜奶中培养24h。对人工染菌的食品样品先进行增菌，而后用试剂盒提取致病菌基因组DNA进行PCR检测。以未染菌的食品作为阴性对照。2结果2.1菌种及靶点在NCBI的编号针对试验所用的沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌O157H7、金黄色葡萄球菌这3个菌种，及挑选定出的靶基因，从NCBI网站上下载3种菌的基因组及其特异性靶点的序列。2.2单重PCR反响体系验证结果分别使用3种食源性致病菌所特有的特异性引物进行单重PCR反响，均能扩增出与估计大小相符的目的条带图1，且无非特异性条带和二聚体；肠出血性大肠杆菌O157H7的rfbE基因287bp；金黄色葡萄球菌的nuc基因354bp；沙门氏菌的hilA基因468bp；Marker和PCR产物的上样量均为400ng。回收3个PCR产物进行测序，并在线与NCBI数据库中的相应种的序列进行比对，比对结果显示序列同源性均在99%以上。2.3PCR反响特异性实验将3种致病菌的基因组DNA等量混合为模板，分别用一对引物进行PCR反响，结果显示肠出血性大肠杆菌O157H7引物只能扩增出肠出血性大肠杆菌O157H7中287bp大小的条带，没有非特异性条带和引物二聚体；金黄色葡萄球菌引物只能扩增出金黄色葡萄球菌的354bp大小的条带，无非特异性条带和引物二聚体；同样沙门氏菌引物也只能扩增出沙门氏菌468bp大小的条带，无其他非特异性条带。这讲明所设计的引物具有高度特异性。2.4多重PCR反响体系的建立分别将沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌O157H7、金黄色葡萄球菌的基因组DNA等量混合为模板，按优化的多重PCR反响体系进行扩增，结果图2显示，双重PCR反响后在相应大小位置处出现了两条特异性条带，三重PCR反响后，在354、287和468bp处分别出现了明显的特异性目的条带，且无非特异性条带和引物二聚体的构成，Marker和PCR产物的上样量均为400ng。经太多次试验，确定多重PCR的反响体系为：50L：Taq酶0.25L，10×PCRBuffer5L，dNTPMixture4L，模板DNA溶液3L，引物20mol/l各1L，加去离子水至50L。2.5人工模拟样品的PCR检测将沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌O157H7和金黄色葡萄球菌的培养液单独接种至鲜奶中或任意两两等量混合取少量接种至鲜奶中培养。经增菌后提取致病菌基因组DNA进行PCR反响，结果图3显示，未加致病菌的鲜奶不能检测出特异性条带，而接种相应致病菌的鲜奶均能检测出对应的特异性目的条带，Marker和PCR产物的上样量均为400ng。以上结果讲明本研究所建立的多重PCR检测方法可应用于食品中的肠出血性大肠杆菌O157H7、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌3种致病菌的检测，且该方法均有较高的特异性。3讨论在经济发展的当代，健康成为人们越来越关注的问题，食品的安全问题成为社会关注的焦点。PCR快速检测技术由于其特异性强和灵敏度高，操作简单，消耗时间和试剂少，现已用于肝炎、艾滋病、疱疹病毒感染诊断16，也成为了食源性致病菌的重要检验方法之一。在PCR检测技术基础上发展起来的多重PCR技术也广泛地应用于食品检测方面。目前用于检测沙门氏菌的靶基因的引物基因主要有invA、invB、invC、invD、invE、hilA、fimA、hns、spv和16SrRNA，血清群特异性引物基因rfb基因和血清型特异性引物基因fliC、fljB和via基因等13。目前用于检测肠出血性大肠杆菌O157：H7时，主要的毒力基因有：编码志贺毒素stx1和stx2基因、编码与细菌黏附作用有关的蛋白eaeA基因、编码溶血素hly基因14。目前，用于检测金黄色葡萄球菌肠毒素SE的相关靶基因有sea、seb、sec、sed、see、seh、sei和sej基因13，以及编码耐热核酸酶基因nuc，编码血浆凝固酶coa基因15。通过实验，本研究所设计的沙门氏菌的引物hilA-f可有效扩增出468bp的特异性基因片段，肠出血性大肠杆菌O157H7的引物rfbE-f可有效扩增出287bp的特异性基因片段，金黄色葡萄球菌的引物nuc-f可有效扩增出354bp的特异性基因片段，这3对引物可成功用于致病菌的多重PCR快速检测，此前未见报道。在食品中人工添加3种致病菌沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌O157H7和金黄色葡萄球菌，利用本实验所设计的3对引物可成功的进行多重PCR的快速检测。本研究所建立的PCR反响系统具有较好的特异性，为食品中常见致病菌的检测提供了一种快速、简便、准确的方法，具有重要的理论意义及实践意义。同时多重PCR能够与其他技术相结合，如荧光定量PCR相结合，可提高检测效率。或是与其他检测方法相结合，如基因芯片、实时PCR等，能够创造一个更完好的体系。4结论本研究针对常见的3种食源性致病菌肠出血性大肠杆菌O157H7的rfbE基因、金黄色葡萄球菌的nuc基因及沙门氏菌的hilA基因，设计出相对应的特异性引物，单重PCR结果显示能扩增出与估计大小一致的片段，没有非特异性扩增。使用设计的引物对人工感染的鲜奶进行检测，结果表明未加致病菌的鲜奶不能检测出特异性条带，而接种相应致病菌的鲜奶均能检测出对应的特异性目的条带。