真空采血管对血浆血清多肽质谱的影响.docx

真空采血管对血浆血清多肽质谱的影响摘要：目的观察不同添加剂处理的真空采血管留取标本对患者血浆/血清多肽检测的影响，确立血浆/血清多肽质谱分析临床适用的采血管。方法招募6名志愿者，男性2例，年龄(28±2)岁；女性4例，年龄(30±3)岁，采集志愿者的静脉血液样本放入6种临床上日常使用的真空采血管，并按采血管的种类分为6组。采用弱阳离子磁珠提取多肽，Clin-TOF平台进行检测，通过BioExplorer软件和SPSS22.0进行多肽峰的比拟。结果6组采血管共出峰117个，108个多肽峰具有差异(P0.05)，95个具有显著差异(P0.01)，血浆管之间差异峰的数量显著高于血清管之间；分离胶促凝管正态分布的血清多肽峰最多(110个)，且峰强度大于300的强势峰出峰数均值最高，标准差最小(27.7±1.97)；根据正态分布多肽峰数、强势峰出峰均值、全峰强度、强势峰强度这四个指标进行因子分析，分离胶促凝管得分最高。结论含有分离胶的促凝管是最适用基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱分析的最佳采血管。关键词：多肽；血浆；基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱；近年来，质谱技术在生命科学领域发展迅速并广泛应用，涉及了多个学科。目前常用的质谱技术之一基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)，因其高灵敏度、高准确度、高通量、易于自动化等特点，为其在检验医学领域的应用提供了广阔的前景和发展空间1-3。质谱技术可用来寻找体内特异的生物标志物，进而对疾病的早期诊断起到独特高效的挑选作用，到达理想的疾病早期预警目的。质谱技术能够对多种生物样本进行检测，其中血液样本以其取材方便、样本稳定度高、容易保存等特点更广泛的应用于临床。因检测需要，血液样本采集常使用添加了不同抗凝剂或促凝剂的真空采血管，对于不同真空采血管对生化指标的影响已有大量报道4-6。随着质谱技术在临床的推广应用，相应的分析前实验条件的探索应同时开展。本文观察不同真空采血管中的添加剂对质谱分析的影响，以挑选出对质谱分析效果最佳的真空采血管。材料和方法1样本获取招募志愿者6名(男性2名，女性4名)，平均年龄30岁，编号A、B、C、D、E、F。采集每名志愿者6份血液样本放入6种临床上日常使用的真空采血管中。按采血管的种类分为6组(第1组为添加枸橼酸钠的抗凝采血管，编号A1、B1F1；第2组为添加EDTA2K的抗凝采血管，编号A2、B2F2；第3组为添加肝素锂的抗凝采血管，编号A3、B3F3；第4组为添加氟化钠的抗凝采血管，编号A4、B4F4；第5组为无添加的促凝采血管，编号A5、B5F5；第6组为添加分离胶的促凝采血管，编号A6、B6F6)。放置15min后，3000g离心10min后进入质谱分析的前处理流程。2试剂与仪器血浆/血清多肽提取和测定为血浆/血清低丰度多肽。主要试剂有多肽提取用的SPE-C磁珠试剂盒(Bioyong，中国)，标准品Peptidecalibrationstandard和标准品Proteincalibrationstandard(Sigma，德国)，基质-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)(Sigma，德国)，100%色谱级丙酮和100%色谱级乙醇(J.K.Baker，美国)。主要消耗品包括：96targetsAnchorchip靶(BrukerDalton，德国)，排管(Axygen，美国)，eppendorf管(Axygen，美国)，枪头(Axygen，美国)，移液器(Eppendorf，德国)，磁架(Bioyong，中国)。检测仪器为基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)Clin-TOF-(北京毅新博创生物科技有限公司，中国)。3样品前处理与质谱分析血浆多肽提取流程根据试剂盒标准流程操作，血浆质谱分析操作流程根据布鲁克道尔顿公司提供的标准操作流程进行。将200l样品管置于孔板上，依次参加10l磁珠，参加95l磁珠结合缓冲液(CB)，参加10l血浆样本，在室温静置。将样品管在磁珠分离器上静置1min，磁珠富集到管底并贴壁，与悬浮的液体分离，吸去上清的液体。将样本放入孔板中，参加100l磁珠清洗缓冲液，吸去上清液体，并重复此步骤，保证上清液完全被吸走。将样品放置于孔板上，参加10l磁珠洗脱液(CE)反复吸打，静置，将上清液移出到已标记的0.2ml的样品管中待测。Clin-TOF仪器检测，点靶前对仪器进行校正，点靶方式为覆盖法，将点好多肽提取物的靶放入Clin-TOF仪器中，点击激光Shot，累积Shot图。质谱采用的是线性形式，每个样本采集50个frofile，每个frofile10个shots，荷质比范围M/Z1000-10000。所有样本的累积激光Shot图用BE软件和SPSS22.0进行生物信息学分析和统计学分析，寻找鉴定差异峰。4优选标准根据正态分布多肽峰数、强势峰出峰数均值、全峰强度、强势峰强度进行因子分析和排序，得分最高者为最优采血管。5统计学处理应用BioExplorer软件(Bioyong，中国)和SPSS22.0进行数据分析，血浆/血清多肽峰的正态性检验采用AdersonDarlingTest。峰强度和出峰数用-x±s表示，行因子分析和排序。组间差异多肽峰的比拟为One-WayAnova+两两比拟LSD检验，或非参数分析KruskalWallisTest。检验水准=0.05。1血浆多肽峰的正态性/变异分析6组样本共出峰117个，同一人的6种真空采血管血浆多肽峰的图谱形态不同(见图1)。在117个多肽峰中，符合正态分布的多肽峰最多的为第6组含分离胶的促凝管(110个)，其次为第3组(106个)、第5组(102个)、第2组(95个)、第4组(90个)、第1组(90个)，表明第6组的真空采血管所采集的血浆多肽峰变异最小。2差异多肽峰分析117个多肽峰中组间差异峰有108个(P0.05)，其中P0.01的差异峰为95个。组1组4为血浆管，组5和组6为血清管。组间两两比拟，2组和6组之间差异峰数量最多(92个)，5组和6组之间差异峰的数量最少(4个)，见表1。讲明在差异峰的数量上，不仅血浆管与血清管之间存在显著差异，即便是血浆管之间也存在差异，但以血清管之间差异最小，血浆管与血清管之间差异最大。6组中峰强度最大的前10个多肽峰除第3组多肽峰1277.0m/z外(P=0.449)，均为差异峰(P0.01)(见图2)。讲明采血管的种类不同也造成了各组强势峰的显著性差异。3强度300的强势峰出峰数比拟应用Bioex-plorer软件采集每个样本血浆/血清多肽峰强度300的出峰数和强度，比拟出峰情况，考察均一性。各组出峰数均值分别为26.7±4.50(1组)，26.3±3.67(2组)，22.7±3.08(3组)，25.7±3.67(4组)，26.3±2.80(5组)，27.7±1.97(6组)，根据每位志愿者的强势峰出峰情况显示，第6组均一性最佳(见表2)。各组全峰强度和强势峰强度比拟，相关性较好(见图3)。4采血管的选择根据正态分布多肽峰数、强势峰出峰数均值、全峰强度、强势峰强度这四个指标进行因子分析和排序(见表3)。根据分析结果，第6组含有分离胶的促凝管得分最高，最合适MALDI-TOFMS质谱分析。基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)是近年来发展起来的一种软电离新型有机质谱，近年来已成为检测和鉴定多肽、蛋白质、多糖、核苷酸、糖蛋白、高聚物以及多种合成聚合物的强有力工具。其原理是：当用一定强度的激光照射样品与基质构成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量，基质-样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，电离的样品在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测。MALDI-TOF-MS的中心技术就是依样品的质荷比(m/z)的不同来进行检测，并测得样品分子的分子量7。本研究中采用磁珠提取血浆/血清多肽，磁珠试剂盒以弱阳性离子交换原理为基础，采用磁珠在高盐低pH溶液中特异性吸附生物样本中的蛋白质多肽，在低盐溶液中释放蛋白多肽分子，进而捕获血浆/血清中的蛋白质多肽，可直接用于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱的分析。有研究显示，血浆与血清中代谢物浓度有明显差异8-11，基于核磁共振的代谢组学研究证实等离子体、EDTA、肝素和枸橼酸抗凝血剂能够严重影响代谢信息的复原12-13，本实验中不同添加剂的采血管在同一条件下获得的多肽峰出峰图谱具有显著差异，这一试验结果与其他研究相一致。六组样本共出峰117个，其中组间差异多肽峰共108个(P0.05)，讲明采血管中的添加剂对多肽峰的检测具有明显的影响。原因是抗凝或促凝剂激活的凝血经过不同，蛋白在此经过中的水解片段也不同。凝血与纤溶的平衡是动态的，这一经过是一系列的酶促反响，蛋白酶的连续激活与失活，血小板失活导致凝块构成，这些都有可能释放出肽和蛋白质片段14-15。我们的实验结果显示：第六组含分离胶的促凝管样本符合正态分布的多肽峰最多(110个)，讲明用第六组采血管检测出来的样本变异最小，出峰最稳定。在血清中，代谢物的浓度要普遍高于血浆，但两者仍呈现明显的相关性16-17。Breier等的研究指出，血清中101种代谢物浓度显著高于血浆，血清中代谢物的可靠性更高18。我们的研究同样发现：血清管的峰强叠加普遍高于血浆管。血清分离胶作为一种惰性半固体，多由聚酯、聚烯烃和丙烯等材料构成，具有抗氧化、耐高温、抗低温，高度稳定的特点，并具有很强的触变性，可在血清和血细胞之间存在固化屏障，保障血清化学成分的稳定。本研究中对峰强度大于300的多肽峰进行比拟，第六组出峰均值最大，标准差最小，从累积峰强度来看，第六组固然略低于第四组和第五组，但明显高于前三组的血浆管。根据正态分布多肽峰数、强势峰出峰数均值、全峰强度、强势峰强度这四个指标进行综合评价打分，第六组得分最高。综上所述，含有分离胶的促凝管为最适用于质谱分析的真空采血管。