瘦素受体对苏钟猪脂肪沉积调控的影响.docx

瘦素受体对苏钟猪脂肪沉积调控的影响（南京农业大学学报）2015年第五期随着生活水平的不断提高，人们对猪肉品质的要求也越来越高。脂肪沉积是影响猪肉品质和营养价值的一个关键因素，由于脂肪沉积能够影响很多重要的肉质性状，如背膘厚、肌内脂肪含量、瘦肉率等。另外，猪作为一个良好的动物模型，在研究人类肥胖候选基因的研究中发挥重要的作用。因而，开展猪的脂肪沉积机制研究具有重大意义。随着定位克隆、物理作图和候选基因等分子生物学技术的发展，研究人员已成功发现很多影响猪脂肪性状的主效基因，如过氧化物酶体增殖物活化受体基因(PPAs)、肥胖易感基因(FTO)、脂蛋白脂肪酶基因(LPL)等。瘦素受体(LEP)是一种跨膜受体，属于类细胞因子受体家族，由细胞外的配体结合区、跨膜区及胞内区3部分组成。瘦素受体与瘦素(LEP)互相结合发挥着广泛作用，如机体体质量平衡控制。在小鼠上，前人研究发现LEPmNA在越来越多的组织上有表达，包括心、肝、肾、肺、小肠、卵巢和脂肪组织等。在猪上，LEPmNA在脂肪组织、脑、肌肉、脂肪、肝、下丘脑、垂体和繁衍组织(子宫内膜、卵巢)上均有表达。但是，关于中国高脂肪含量猪和低脂肪含量猪LEP的表达差异及表达量、编码序列单核苷酸多态(cSNP)与肉质性状关联分析的报道还很少。苏钟猪是以太湖猪为亲本培育的优质瘦肉型猪，肌间和肌内脂肪丰富，本试验通过实时荧光定量PC方法、免疫印迹和直接测序等技术，从mNA表达、蛋白表达、cSNP挖掘和性状关联等方面分析了LEP对脂肪沉积的影响。1材料与方法11试验动物在江苏洪泽鑫象公司，用背膘仪活体测定背膘厚度大小选取了10头6月龄、(95±3)kg体质量的半同胞健康苏钟猪(高脂猪和低脂猪各半)，这些猪均在同一天被电击昏后屠宰，之后参照屠宰程序1819采集猪的心、肝、肾、眼肌(背最长肌)和背膘等组织样，迅速置于液氮冷冻保存。同时，测定了这些试验猪的脂肪沉积相关性状，包括背最长肌横切面积(求积仪，Haguang)、瘦肉率(SFK，Denmark)、背膘厚(游标卡尺，MNT)等，并根据背膘厚度和试验猪左半边胴体的前躯、中躯和后躯脂肪质量进一步确定了高脂猪和低脂猪(表1)。另外本实验室保存有51头苏钟猪肌肉样或血样，并有这些猪的耳号、出生日期和背最长肌性状(横切面积、pH值、肉色、大理石花纹评分和系水力)等记录，笔者采用高盐法20提取这些猪组织样中的基因组，进行LEP基因的cSNP研究。12引物设计猪LEP基因的cDNA(GenBank:NM_001024587)全长4050bp，其编码序列为第163513bp。LEP_1引物用于T-qPC，LEP_2引物用于LEP第18外显子(27263464bp)的cSNPs检测。所有引物序列均用Oligo60软件设计，由上海英潍捷基(Invitrogen)生物公司合成(表2)。13实时荧光定量PC(T-qPC)利用Trizol(Invitrogen，USA)/氯仿方法从猪组织样中提取总NA，以上述提取的总NA为模板，利用FirstStrandcDNASynthesisKit试剂盒进行反转录，合成cDNA第一链(Fermentas，Lithuania)，25L反响体系，试验步骤参考讲明书进行。利用实时荧光定量PC仪(ABISteponeplus，USA)进行PC扩增。反响体系如下:2×real-timePCMasterMix(SYBGreen)10L，上下游引物(10mmolL1)各1L，模板(cDNA稀释10倍)1L，TaqDNAPolymerase03L，加DEPC水到20L(ABI，USA)。反响条件如下:952min热启动HotStarTaq酶活性;9410s，6040s，共40循环;4595，读板时按01s1进行熔解曲线分析。内参基由于GAPDH。14Westernblot检测蛋白表达组织样用蛋白裂解液裂解，提取出的总蛋白用BCA蛋白定量试剂盒(Invitrogen，USA)检测。Westernblot经过参照Patel等23和付言峰等24的方法，一抗用小鼠抗人LEP抗体(mAb，sc-8391，SantaCruz，USA)，二抗用辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠抗体(A0216，Beyotime，中国)。利用灰度分析软件(Gel-Pro32)分析电泳条带灰度比值(以GAPDH为内参)。15直接测序法检测cSNPs首先进行LEP基因目的片段(cDNA第27263464bp，位于CDS区)的PC扩增。反响体系(15L):7LPremixTaq(TaKaa，China)，6LddH2O，05L各种引物(10pmolL1)和1LDNA。反响条件:945min;9430s，6030s，7260s，共30循环;727min。利用ABI3730XLDNA测序仪(AppliedBiosystems，USA)对上述PC产物进行直接测序，每个样品测序2次，即正向和反向各测1次。测序序列和NCBI序列通过DNAMAN52进行比对，最终得到LEP的cSNPs。16数据处理与统计实时荧光定量PC的数据利用2CT法2526分析，得到LEPmNA的相对表达量。用SAS82统计软件包的GLM程序进行LEPmNA、蛋白表达量、cSNP与脂肪沉积性状之间的关联分析。结果均以最小二乘均值±标准误(LSmeans±SE)表示。2结果与分析21LEPmNA表达对脂肪沉积的影响组织样中提取的总NA利用分光光度计测定出的A260/A280结果大都处于1821的区间，总NA含量为160222gL1，讲明提取的NA质量较高，能够进行后续的T-qPC试验。T-qPC结果表明:LEPmNA在猪心、肝、肾、眼肌(背最长肌)和背膘中均有表达，且不同组织样中的表达量差异显著(P005)。其中背膘的表达量最高，且显著高于其他组织(P005)，其次为背最长肌的表达量，且高脂猪的表达量显著高于低脂猪(P005)(图1)。由于高脂猪的眼肌(背最长肌)面积和瘦肉率显著低于低脂猪(表1)，即高脂猪的脂肪沉积量显著高于低脂猪，结合文献报道，笔者揣测猪脂肪沉积增加，引起LEPmNA表达量升高，促进脂肪分解，控制猪只体质量的平衡。22LEP蛋白表达对脂肪沉积的影响Westernblot结果表明:猪LEP蛋白(NCBIProtein:NP_001019758)在苏钟猪的心脏、肝脏、肾脏、背最长肌和背膘组织中均有表达，且不同组织间表达量差异显著(P005)，其中背膘中的表达量最高，显著高于其他组织样，其次为背最长肌，而肾脏中的LEP蛋白表达量最低(图2)。高脂猪的LEP蛋白表达量显著高于低脂猪(P005)(图2)，这与LEPmNA的表达结果一致。考虑到高脂猪的背膘厚显著高于低脂猪，背最长肌面积和瘦肉率显著低于低脂猪(P005)(表1)，即高脂猪的脂肪沉积更高，联络到其蛋白表达情况，笔者分析猪肉脂肪沉积增加(背膘增加)，可能引起LEP蛋白表达量升高，进而更好发挥LEP促进脂肪分解、控制体质量平衡的功能。23LEP的cSNPs挖掘笔者对LEP基因cDNA序列第27263464bp(位于CDS区，覆盖了第18外显子9265%的序列)进行了直接测序扫描，结果发现3个cSNPs，即c.2856CT，c2935CT和c3155CT。3个位点的突变均为CT的突变。这3个cSNPs中，只要c.2856CT位点有3种基因型，呈现多态性，分别为CC、CT和TT基因型(图3)。24LEP的cSNPs对脂肪沉积的影响LEP的cSNPs(c.2856CT)基因型与脂肪沉积相关肉质性状的关联分析结果表明:对于背最长肌面积/体质量、瘦肉率、pH值和肉色评分，CC基因型显著大于TT基因型(P005);相反，对于肉色L*值、肉色a*值和大理石花纹评分，CC基因型显著小于TT基因型(P005)。考虑到背最长肌面积/体质量、瘦肉率和肉色a*值，低脂猪极显著大于高脂猪(P001)。笔者揣测，TT基因型猪关联的肉质性状中，背最长肌肉色更亮、大理石花纹更丰富、瘦肉率和眼肌面积更低，与高脂猪的肉质性状结果类似，即TT基因型更有利于猪的脂肪沉积，T等位基因是脂肪沉积有利等位基因(表3)。3讨论脂肪沉积能够影响猪的肉质性状，如背膘厚、背最长肌面积和肌内脂肪含量等，这些肉质性状又进一步影响猪肉的品质，如适口性、香气、嫩度等，直接决定了猪肉的品质和价格，所以猪育种工作者对其越来越重视。关于影响脂肪沉积的基因有肥胖易感基因(FTO)、氟烷基因(halothane)27、激酶插入域受体(Kinaseinsertdomainreceptor，KD)基因等。而本文的瘦素受体(LEP)基因与瘦素(leptin)互相结合后，在体质量平衡、脂肪沉积经过中发挥着重要的作用。关于其在中国本地猪种不同脂肪含量猪中的研究还鲜有报道，所以本试验开展了LEP的mNA和蛋白表达及cSNPs对猪脂肪沉积的影响研究。T-qPC结果表明:LEPmNA在苏钟猪的心、肝、肾、背最长肌和背膘5种组织中均有表达，且背膘中的表达量显著高于其他组织，这与前人报道的LEP在其他品种猪的表达结果一致。苏钟猪高脂猪的脂肪沉积高于低脂猪，且高脂猪LEPmNA表达量显著高于低脂猪，讲明脂肪沉积越高，LEPm-NA表达量越高。揣测原因可能是脂肪沉积增加引起LEP表达量增加，进而促进脂肪分解，控制猪只体质量平衡。有研究对波兰5个品种猪分别添加能量饲料后，LEP在各品种猪肌肉组织的表达量均随着年龄增长而显著升高。Westernblot结果表明:LEP蛋白在苏钟猪的心、肝、肾、背最长肌和背膘中均有表达，其中背膘中的表达量最高，且高脂猪的蛋白表达量显著高于低脂猪(P005)，这与LEPmNA表达趋势一样。高脂猪比低脂猪的脂肪含量高、瘦肉率低，而LEPmNA和蛋白的表达量都更高，前人对LEP配体leptin也有类似的研究结果，其发现瘦肉率高的猪leptinmNA表达量更低，讲明瘦肉率与leptin的表达量也成反比。另有报道，LEP在高肌内脂肪含量猪背最长肌的表达量显著高于低肌内脂肪含量猪。PC-sequencing和关联分析结果表明，LEP部分编码序列中检测到3个cSNPs多态位点，其中c.2856CT多态位点对瘦肉率、肉色、大理石花纹评分等肉质性状影响显著，T等位基由于脂肪沉积的有利等位基因。这个SNP突变不直接引起氨基酸的改变，但其能够通过与其他SNP的连锁不平衡间接引起氨基酸的改变。有研究表明，LEP多态性显著关联着杜洛克×长白×大白三元杂交猪的脂肪含量、脂肪分布和脂肪组成，LEP多态性显著关联韩国本地猪×大白二元杂交猪的系水力、肌内脂肪、胆固醇和风味评分。综上所述，LEPmNA和蛋白在苏钟猪的背膘和背最长肌中均有高表达量，且高脂猪的LEP表达量显著高于低脂猪，可能是脂肪沉积的增加引起LEP的表达量增加，进而使LEP更好得发挥其“促进脂肪分解，控制猪只体质量平衡的作用;LPE多态位点c.2856CT中T为脂肪沉积的有利等位基因。上述结果表明LEP基因对猪的脂肪沉积有一定影响，能够作为苏钟猪肉质改进育种中重要的候选基因。