基因工程的基本操作程序.ppt

基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序基因的结构原核生物的基因结构原核生物的基因结构基因的结构真核生物的基因结构真核生物的基因结构真核生物的编码区是不连续的、间隔的真核生物的编码区是不连续的、间隔的(分外显子和内含子分外显子和内含子)原核生物的编码区是连续的不间隔的原核生物的编码区是连续的不间隔的基因工程的基本程序基因工程的基本程序 第一步第一步:获取目的基因获取目的基因 第二步第二步:基因表达载体的基因表达载体的构建构建 第三步第三步:将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞 第四步第四步:目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定 主要是指主要是指编码蛋白质编码蛋白质的基因的基因（一）目的基因（一）目的基因 目前被广泛提取使用的目的基因有：目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因人胰岛素基因人胰岛素基因等。等。第一步:目的基因的获取目的基因的获取1 1、从基因文库中直接获取、从基因文库中直接获取（1 1）基因文库的概念）基因文库的概念部分基因文库：部分基因文库： 基因组文库：基因组文库： 将含有某种生物将含有某种生物不同不同基因的许多基因的许多DNADNA片断，导入到片断，导入到受体菌的受体菌的群体群体中，中，各个受体菌各个受体菌分别含有这种生物的分别含有这种生物的不不同基因同基因，称为基因文库，称为基因文库含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分基因部分基因，如如:cDNA:cDNA文库文库（二）目的基因的获取（2 2）基因文库的建立方法基因文库的建立方法提取某种生物的全部提取某种生物的全部DNADNA用适当的限制酶酶切用适当的限制酶酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段与运载体连接片段与运载体连接导入受体菌中储存导入受体菌中储存基因组文库基因组文库方法一：直接分离法方法一：直接分离法( (鸟枪法鸟枪法) )某种生物的单链某种生物的单链mRNAmRNA单链互补单链互补DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段导入受体菌中储存导入受体菌中储存与运载体连接与运载体连接cDNAcDNA文库文库反（逆）转录酶反（逆）转录酶DNADNA聚合酶聚合酶方法二：反转录法方法二：反转录法-cDNA-cDNA的合成流程图解的合成流程图解2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 PCRPCR技术的技术的名称叫什么名称叫什么? ?其其原理是什么原理是什么? ?其其做法包括几步做法包括几步? ?需要什么条件需要什么条件? ?3、人工合成：如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可以通过DNA合成仪直接人工合成。第二步:基因表达载体的构建核心启动子启动子 启动子：启动子：位于基因首端一段能与位于基因首端一段能与RNARNA聚合酶聚合酶结合并能结合并能驱动基因转录出驱动基因转录出mRNAmRNA合成的序列。没有启动子，基因就合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。不能转录。 RNA RNA聚合酶聚合酶: :能够识别能够识别启动子上的结合位点启动子上的结合位点并与其结并与其结合的一种蛋白质合的一种蛋白质. . 终止子：终止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片断，它片断，它能阻碍能阻碍RNARNA聚合酶的移动，并使其从聚合酶的移动，并使其从DNADNA模板链上脱离模板链上脱离下来，使转录终止。下来，使转录终止。终止子终止子启动子启动子终止子终止子 构建基因表构建基因表达载体的目的是达载体的目的是什么什么?基因表达基因表达载体的组成包括载体的组成包括哪几部分哪几部分?各有各有什么作用什么作用?b b、目的基因、目的基因a a、启动子、启动子c c、终止子、终止子d d、标记基因、标记基因e e、复制原点、复制原点内皮素（内皮素（ETET）是一种多肽）是一种多肽, ,主要通过与靶细胞膜上的主要通过与靶细胞膜上的ETET受体受体（ETETA A）结合而发挥生物学效应。科研人员通过构建表达载）结合而发挥生物学效应。科研人员通过构建表达载体，实现体，实现ETETA A基因在大肠杆菌细胞中的高效表达，其过程如基因在大肠杆菌细胞中的高效表达，其过程如下图所示，图中下图所示，图中SNAPSNAP基因是一种荧光蛋白基因，限制酶基因是一种荧光蛋白基因，限制酶ApaApa的识别序列为的识别序列为 ，限制酶，限制酶XhoXho的识别序列的识别序列为为 。请据图分析回答：。请据图分析回答： （1 1）进行过程）进行过程时，需要加入缓冲液、引物、和时，需要加入缓冲液、引物、和_酶等。完成过程酶等。完成过程的目的是的目的是_。（2 2）构建的重组表达载体，目的基因上游的启动子是）构建的重组表达载体，目的基因上游的启动子是_的部位，进而可驱动基因的转录。除图中已的部位，进而可驱动基因的转录。除图中已标出的结构外，基因表达载体还应具有的结构是标出的结构外，基因表达载体还应具有的结构是_。 获取目的基因获取目的基因反转录反转录RNARNA聚合酶识别和结合聚合酶识别和结合 终止子终止子科学家将人的生长激素基因与大肠杆菌的科学家将人的生长激素基因与大肠杆菌的DNADNA分子进行分子进行重组，并成功地在大肠杆菌中得以表达。但在进行基因重组，并成功地在大肠杆菌中得以表达。但在进行基因工程的操作过程中，需使用特定的限制酶切割目的基因工程的操作过程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶的识别序列和的识别序列和切点是切点是GGGATCCGATCC，限制酶，限制酶的识别序列和切点是的识别序列和切点是GATCGATC，请据图回答：，请据图回答：在构建基因表达载体的过程中，应用限制酶在构建基因表达载体的过程中，应用限制酶_切割质粒，用限制酶切割质粒，用限制酶_切割目的基因。用限制切割目的基因。用限制酶切割目的基因和载体后形成的黏性末端通过酶切割目的基因和载体后形成的黏性末端通过_原则进行连接。人的基因之所原则进行连接。人的基因之所以能与大肠杆菌的以能与大肠杆菌的DNADNA分子进行重组，原因是分子进行重组，原因是_。 碱基互补配对 人的基因与大肠杆菌DNA分子的双螺旋结构相同将得到的大肠杆菌将得到的大肠杆菌B B涂布在一个含有氨苄青霉素的培涂布在一个含有氨苄青霉素的培养基上，得到如图养基上，得到如图a a所示的结果（圆点表示菌落），所示的结果（圆点表示菌落），该结果说明能够生长的大肠杆菌中已导入了该结果说明能够生长的大肠杆菌中已导入了_，反之则没有导入；再将灭，反之则没有导入；再将灭菌绒布按到培养基菌绒布按到培养基a a上，使绒布表面沾上菌落，然后上，使绒布表面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图b b所所示的结果（圆圈表示与图示的结果（圆圈表示与图a a中培养基上对照无菌落的中培养基上对照无菌落的位置）。与图位置）。与图b b圆圈相对应的图圆圈相对应的图a a中的菌落表现型是中的菌落表现型是_，这些大肠杆菌中导入了，这些大肠杆菌中导入了_。普通质粒或重组质粒普通质粒或重组质粒 抗氨苄青霉素而不抗抗氨苄青霉素而不抗四环素四环素 重组质粒重组质粒第三步:将目的基因导入受体细胞1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞 农杆菌转化法（农杆菌转化法（TiTi质粒）质粒）( (双子叶、裸子植物常用）双子叶、裸子植物常用）基因枪法基因枪法(单子叶植物常用单子叶植物常用)花粉管通道法2.将目的基因导入动物细胞显微注射技术显微注射技术提纯含目的基提纯含目的基因的表达载体因的表达载体取出卵细胞取出卵细胞显显微微注注射射受精卵移植入受精卵移植入输卵管或子宫输卵管或子宫发育成具新性状的动物发育成具新性状的动物3.将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞 原核生物原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，故早期常作为受体细胞。相对较少，故早期常作为受体细胞。大肠杆菌细胞大肠杆菌细胞用用Ca2+处理处理感受态细胞感受态细胞重组表达载体重组表达载体DNA溶于缓冲液溶于缓冲液混合混合转入转入第四步：目的基因的检测与鉴定1.1.检测是否插入了目的基因检测是否插入了目的基因( (原理原理:DNA:DNA分子杂交技术分子杂交技术) )2.2.检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA( (原理原理:DNA-RNA:DNA-RNA杂交技术杂交技术) )3.3.检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质( (原理原理: :抗原抗原- -抗体杂交技术抗体杂交技术) )4.4.个体生物学水平的鉴定个体生物学水平的鉴定思考与探究P151. 1.作为基因工程表达载体，只需含有目作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？的基因就可以完成任务吗？为什么？ 不可以。不可以。 因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：的主要理由是：（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；子才能比较有利于基因的表达；（2） 通过通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；导入受体生物中无法转录；（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；元件，如增强子等；（5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。思考与探究P15 2.2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物，的原因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从理论上说，你应该如何做？如小麦，从理论上说，你应该如何做？ 农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。研究证明，主要酚类诱导物为受伤组织集中。研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。杆菌侵染的原因。 利用农杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化利用农杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时，是需要加上述酚类物质的。时，是需要加上述酚类物质的。 如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：以用农杆菌，但要注意两点： 要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物； 要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的靠拢（趋化性）和激活农杆菌的VirVir区（诱导）区（诱导）的基因，使的基因，使T-DNAT-DNA转移并插入到染色体转移并插入到染色体DNADNA上。上。 3. 3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？杆菌吗？ 有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。可能的。