水产品中氯霉素的快速检测 胶体金免疫层析法（KJ201905）.doc

1附件5水产品中氯霉素的快速检测 胶体金免疫层析法 （KJ201905）1 范围本方法规定了水产品中氯霉素的胶体金免疫层析快速检测方法。 本方法适用于水产品中氯霉素的快速测定。2 原理本方法的测定以竞争抑制免疫层析原理为基础。样品中的氯霉素经有机试剂提取，固相萃 取小柱净化，浓缩复溶后，氯霉素与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和微孔 膜检测线（T 线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线颜色 深浅比较，对样品中氯霉素含量进行定性判定。3 试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的二级水。 3.1 试剂 3.1.1 正己烷。 3.1.2 丙酮。 3.1.3 乙酸乙酯。 3.1.4 乙腈 3.1.5 磷酸二氢钠，NaH2PO4·2H2O。 3.1.6 磷酸氢二钠，Na2HPO4·12H2O。 3.1.7 氯化钠 3.1.8 复溶液：称取 0.12 g 磷酸二氢钠 (3.1.5)置于 100 mL 容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度， 制成溶液 A；称取磷酸氢二钠 7.16 g (3.1.6)置于 100 mL 容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制 成溶液 B。取溶液 A 2.8 mL、溶液 B 7.2 mL、氯化钠(3.1.7)0.85 g，用水溶解并稀释至 100 mL，得磷酸盐缓冲液，即为复溶液。 。 3.1.9 丙酮-正己烷（1+9）：丙酮（3.1.2） 、正己烷（3.1.1）按体积比 1：9 混匀。 3.1.10 丙酮-正己烷（6+4）：丙酮（3.1.2） 、正己烷（3.1.1）按体积比 6：4 混匀。 3.2 标准物质 氯霉素标准物质的中文名称、英文名称、CAS 登录号、分之式、相对分子质量见表 1，纯 度98.6%。表 1 氯霉素参考物质中文名称、英文名称、CAS 登录号、分子式、相对分子质量中文名称英文名称CAS 登录号分子式相对分子量2氯霉素Chloramphenicol56-75-7C11H12Cl2N2O5323.13注：或等同可溯源物质。3.3 标准溶液配制 3.3.1 氯霉素标准储备液（1 mg/mL）：精密称取氯霉素标准物质（3.2）10 mg，置于 10 mL 容 量瓶中，用乙腈（3.1.4）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为 1 mg/mL 的氯霉素标准储备液。4避光保存，有效期 6 个月。 3.3.2 氯霉素标准中间液 A（10 g/mL）：精密量取氯霉素标准储备液（1 mg/mL） （3.3.1）0.1 mL，置于 10 mL 容量瓶中，用乙腈（3.1.4）稀释至刻度，摇匀，制成 10 g/mL 的氯霉素标准 中间液 A。4避光保存，有效期 3 个月。 3.3.3 氯霉素标准工作液（0.01 g/mL）：精密移取氯霉素标准中间液 A（10 g/mL） （3.3.2） 0.01 mL 分别置于 10 mL 容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，制成浓度为 0.01 g/mL 的氯霉 素标准工作液。临用新配。 3.4 材料 3.4.1 固相萃取小柱：Cleanert Silica，200 mg/6mL。LOT：0170198。 3.4.2 免疫胶体金试剂盒（在 230、干燥阴凉条件下保存，在产品有效期内使用） 。 3.4.2.1 金标微孔。 3.4.2.2 试纸条或检测卡。4 仪器和设备4.1 移液器：200 L、1 mL 和 5 mL。 4.2 涡旋混合器。 4.3 离心机：转速4000 r/min。 4.4 电子天平：感量分别为 0.01 mg 和 0.01 g。 4.5 样品浓缩仪：如有需要。 4.6 环境条件： 温度：1525，相对湿度：60%。5 分析步骤5.1 试样制备 取具有代表性样品约 500 g，充分粉碎混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样和留 样，密封，标记，于常温保存。 5.2 试样提取和净化 准确称取试样 6 g（精确至 0.01 g）置于 50 mL 具塞离心管中，依次加入 1 mL 水和 8 mL 乙酸乙酯（3.1.3） ，涡旋提取 5 min，以 4000 r/min 离心 5 min。转移全部乙酸乙酯层于 50 mL 具塞离心管中，加入正己烷 25 mL，氯化钠 1 g 涡旋混匀，4000 r/min 离心 1 min，上清液待净 化。5 mL 丙酮-正己烷（1+9） （3.1.9）淋洗 LC-Si 硅胶小柱，弃去淋洗液，将待净化溶液转移 到固相萃取小柱上，弃去流出液，用 5 mL 丙酮-正己烷（6+4） （3.1.10）洗脱，收集洗脱液，洗 脱液于 40氮气吹干，精密加入 600 µL 复溶液（3.1.8） ，涡旋混合 1 min，作为待测液。 5.3 测定步骤 5.3.1 检测卡与金标微孔测定步骤 吸取 150 µL 样品待测液于反应微孔（3.4.2.1）中，抽吸 510 次使混合均匀，室温温育 3 min；温育结束后，将金标微孔中溶液滴加到检测卡（3.4.2.2）上的加样孔中，室温温育 58 min，对结果进行判定。 5.3.2 试纸条与金标微孔测定步骤 吸取 150 µL 样品待测液于反应微孔（3.4.2.1）中，抽吸 510 次使混合均匀，室温温育 3 3min；温育结束后，将检测试纸条（3.4.2.2）吸水海绵端垂直向下插入反应微孔中，室温温育 3 min，从微孔中取出试纸条，去掉试纸条下端的吸水海绵，并于 5 min 内进行结果判定。 5.3.3 检测卡测定步骤 吸取 150 µL 样品待测液滴加到检测卡（3.4.2.2）上的加样孔中，室温温育 58 min，对结 果进行判定。 5.4 质控试验 每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。 5.4.1 空白试验 称取空白试样，按照 5.2 和 5.3 步骤与样品同法操作。 5.4.2 加标质控试验 准确称取空白样品 6 g 或适量（精确至 0.01 g）置于 15 mL 具塞离心管中，加入 180 L 氯 霉素标准工作液（0.01 g/mL） （3.3.3） ，使氯霉素浓度为 0.3 g/kg，一式 2 份，按照 5.2 和 5.3 步骤与样品同法操作。6 结果判定要求通过对比控制线和检测线的颜色深浅进行结果判定。由于长时间放置会引起检测线颜色的 变化，需在规定时间内进行结果判定。目视结果判读依据如图 1 所示。 6.1 无效 控制线（C 线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。 6.2 阳性结果 检测线（T 线）不显色或检测线（T 线）颜色比控制线（C 线）颜色浅，表明样品中氯霉 素含量高于方法检测限，判定为阳性。 6.3 阴性结果 检测线（T 线）颜色比控制线（C 线）颜色深或者检测线（T 线）颜色与控制线（C 线）颜 色相当，表明样品中氯霉素含量低于方法检测限，判定为阴性。46.4 质量控制要求 空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。7 结论如被测样品中氯霉素检测结果为阳性时，应采用确证方法进行确证检测。8 性能指标8.1 检测限 氯霉素为 0.1 g/kg。 8.2 灵敏度 灵敏度应98%。 8.3 特异性 特异性应90%。 8.4 假阴性率 假阴性率应1%。 8.5 假阳性率 假阳性率应10%。注：性能指标计算方法见附录 A9 其他本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不 做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法 规定的各项性能指标。 本方法参比标准为 GB/T 22338-2008 动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定 (包括所有 修改单)。5附录 A 定性方法性能计算表检验结果b 样品情况a 阳性阴性总数阳性N11N12N1.=N11+N12阴性N21N22N2.=N21+N22总数N.1=N11+N21N.2=N12+N22N=N1.+N2.或 N.1+N.2显著性差异(2)2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21),自由度（df）=1灵敏度（p+）p+=N11/N1.特异性（p-）p-=N22/N2.假阴性率(pf-)pf-=N12/N1.=1-灵敏度假阳性率(pf+)pf+=N21/N2.=1-特异性相对准确度（N11+N22）/(N1.+N2.)注：N:任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11 表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2 表示所有的第二列；N12 表 示第一行，第二列。 a 由基准方法检验得到的结果； b 由本方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。本方法负责起草单位：山西省食品药品检验所。 验证单位：陕西省食品药品检验所、广东省药品检验所、四川省食品药品检验检测院。 主要起草人：李倩、阎安婷、陈煜、杨国伟。