DNA重组技术的基本工具概述(PPT 72页).pptx

又叫做又叫做基因拼接技术基因拼接技术或或DNA重组技术重组技术。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，然后放到另一种生物的细胞里，定向定向地改地改造生物的造生物的遗传性状遗传性状。原理原理：操作水平操作水平：结结 果果：基因重组基因重组DNA分子水平分子水平定向地改造生物的遗传性状，获得人定向地改造生物的遗传性状，获得人类所需要的品种。类所需要的品种。基因工程：基因工程：1、大多数生物的遗传物质都是、大多数生物的遗传物质都是DNA，且主要为双螺，且主要为双螺旋结构，即不同生物的旋结构，即不同生物的DNA分子基本结构是相同的，分子基本结构是相同的，都遵循碱基互补配对原则都遵循碱基互补配对原则 。所以不同的生物。所以不同的生物DNA可以嫁接可以嫁接 2、地球上的所有生物共用一套遗传密码，所以，一、地球上的所有生物共用一套遗传密码，所以，一种生物的基因可以在另外一种生物体内得以表达种生物的基因可以在另外一种生物体内得以表达DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具v准确切割准确切割DNA的工具（的工具（“分子手术刀分子手术刀”）限制性内切酶限制性内切酶vDNA片段的连接工具（片段的连接工具（“分子缝合针分子缝合针”）DNA连接酶连接酶v基因转移工具（基因转移工具（“分子运输车分子运输车”）基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体特特 点点来来 源：源：作作 用：用：中轴线中轴线在在G与与A之之间切割间切割大肠杆菌的一种限制酶大肠杆菌的一种限制酶(EcoR)(EcoR)只能识只能识GAATTCGAATTC序列序列，并在并在G G和和A A之间切开。之间切开。举例：举例：黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端EcoRIEcoRI限制酶的切割限制酶的切割 被限制酶切开的被限制酶切开的DNA两条两条单链的切口，带有几个单链的切口，带有几个伸出的伸出的核苷酸核苷酸，他们之间正好互补配他们之间正好互补配对，这样的切口叫对，这样的切口叫黏性末端黏性末端。SmaISmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。中轴线SmaISmaI限制酶的作用限制酶的作用在G与C之间切割SmaISmaI限制酶的切限制酶的切割割当限制酶当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，从识别序列的中心轴线处切开时，切开的切开的DNADNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端平末端。 你能推测限制酶存在于原核生物中的作用你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？是什么吗？寻根问底寻根问底 限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，切割掉，以保证自身的安全。所以，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中限制酶在原核生物中主要起到切割外源主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到、使之失效，从而达到保护自身的目的。保护自身的目的。DNADNA被限制酶切断后有两个反向互补的被限制酶切断后有两个反向互补的“黏黏性末端性末端”。被同一种限制酶切断的几个。被同一种限制酶切断的几个DNADNA具有具有相同的黏性末端，能够通过互补进行配对。相同的黏性末端，能够通过互补进行配对。基因的针线：基因的针线：DNA连接酶连接酶G A A T T CC T T A A GG A A T T CC T T A A GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C G用同种限制酶切割用同种限制酶切割、基因的针线、基因的针线DNADNA连接酶连接酶连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的端连接起来，使之成为一个完整的DNADNA分子。分子。类型来源功能相同点差别EcoliDNA连接酶连接酶T4DNA连接酶连接酶大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)阅读课本第阅读课本第5页页“分子缝合针”DNA连接酶的相关内容，填写下表的相关内容，填写下表自主学习自主学习DNA连接酶连接酶DNA聚合酶聚合酶相相同同点点作用实质作用实质化学本质化学本质不不同同点点模板模板作用对象作用对象 作用结果作用结果用途用途都能催化形成都能催化形成磷酸二酯键磷酸二酯键都是蛋白质都是蛋白质不需要不需要需要需要形成完整的重形成完整的重组组DNA分子分子形成形成DNA的一条的一条链链基因工程基因工程DNA复制复制DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶的比较聚合酶的比较只能将只能将单个核苷单个核苷酸酸连接到已有的连接到已有的DNADNA片段上，形片段上，形成磷酸二酯键成磷酸二酯键在两个两个DNADNA片片段之间段之间形成磷酸二酯键不同点：不同点： 连接酶的作用是连接酶的作用是：将：将DNA片段间片段间互补互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的一个完整的DNADNA分子。分子。 DNA聚合酶和聚合酶和DNA连接酶有何相同和连接酶有何相同和不同点？不同点？聚合酶聚合酶：以一条以一条DNA为模板，将一个一个为模板，将一个一个核苷酸连接起来核苷酸连接起来相同点：相同点：都是通过形成都是通过形成磷酸二酯磷酸二酯键连接起来键连接起来载体的作用载体的作用载体的必载体的必要条件要条件载体的种类载体的种类阅读课本第阅读课本第6页页“分子运输车分子运输车”运载体运载体的相关内容，填写下表的相关内容，填写下表自主学习自主学习细菌的质粒细菌的质粒病毒：病毒：、动植物病毒等。、动植物病毒等。 有标记基因的存有标记基因的存在，可用含青霉在，可用含青霉素的培养基鉴别。素的培养基鉴别。有切割位点有切割位点能复制并带着能复制并带着插入的目的基插入的目的基因一起复制因一起复制质粒质粒裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体（即拟核裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体（即拟核DNA）之外，并具有）之外，并具有自我复制能力自我复制能力的很小的双链环状的很小的双链环状DNA分子。分子。最常用运载体最常用运载体质粒质粒 实际上实际上在基因在基因工程操作中，工程操作中，真正被用作载真正被用作载体的质粒，都体的质粒，都是在天然质粒是在天然质粒的基础上进行的基础上进行过人工改造的。过人工改造的。基因的运输工具基因的运输工具质粒质粒能复制并带着插能复制并带着插入的目的基因一入的目的基因一起复制起复制有切割位点有切割位点有标记基因的存有标记基因的存在，将来可用含在，将来可用含青霉素的培养基青霉素的培养基鉴别。鉴别。基因工程的基本操作程序主要包括基因工程的基本操作程序主要包括四个基本步骤：四个基本步骤：1 1）目的基因的获取）目的基因的获取2 2）基因表达载体的构建）基因表达载体的构建3 3）将目的基因导入受体细胞）将目的基因导入受体细胞4 4）目的基因的检测与鉴定）目的基因的检测与鉴定步骤一：目的基因的获取 目的基因是人们所需要转移或改造的基因目的基因是人们所需要转移或改造的基因, ,获取目的基因是实施基因工程的第一步获取目的基因是实施基因工程的第一步 。 如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。补：原核细胞的基因结构补：原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子 RNARNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。并与其结合。 转录开始后，转录开始后，RNARNA聚合酶沿聚合酶沿DNADNA分子移动，并分子移动，并以以DNADNA分子的一条链为模板合成分子的一条链为模板合成RNARNA。 转录完毕后，转录完毕后，RNARNA链释放出来，紧接着链释放出来，紧接着RNARNA聚聚合酶也从合酶也从DNADNA模板链上脱落下来。模板链上脱落下来。不能转录为信使不能转录为信使RNARNA，不能，不能 编码蛋白质。编码蛋白质。：能转录相应的信使能转录相应的信使RNARNA，能，能 编码蛋白质编码蛋白质 编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞的的 基因基因结构结构有调控遗传信息表达的核有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中，苷酸序列，在该序列中， 最重要的是位于编码区上最重要的是位于编码区上 游的游的RNARNA聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。启动子启动子补：真核细胞的基因结构补：真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内不能够编码蛋白质的序列叫做内含子含子启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子：内含子： 外显子：外显子： 真核真核细胞细胞的的 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的包括位于编码区上游的RNARNA 聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。非编码序列：非编码序列： 包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具和具有调控作用的有调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较思思考考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的基因主要是指、目的基因主要是指_编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因请举出三个以上的例子请举出三个以上的例子2 2、获取目的基因的常用方法有哪些、获取目的基因的常用方法有哪些? ?（1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增（3 3）人工合成）人工合成请阅读请阅读P9P9第一和二两段第一和二两段( (一一) )从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库称为基因文库基因文库基因文库 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（如（如:cDNA文库）文库）1.1.基因文库基因文库基因组基因组文库与文库与部分基部分基因文库因文库的关系的关系怎样从基因文库中得怎样从基因文库中得到我们所需的目的基到我们所需的目的基因呢因呢? ? 目的基因的提取方法目的基因的提取方法直接分离基因直接分离基因人工合成基因人工合成基因反转录法反转录法根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNADNA：鸟枪法鸟枪法鸟枪法：鸟枪法：供体细胞中的供体细胞中的DNADNA许多许多DNADNA片段片段运载体运载体限制酶限制酶与载体连接与载体连接载入载入受体细胞受体细胞产生特定性状产生特定性状导入导入外源外源DNADNA扩增扩增目的基因目的基因分离分离( (直接分离法直接分离法) )1 1、直接分离基因、直接分离基因2.2.人工合成基因法人工合成基因法2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ： 根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点缺点鸟枪法反转录法根据已知氨基酸合成DNA法操作简便广泛使用工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因专一性强操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高专一性最强仅限于合成核苷酸对较少的简单基因思考思考:为什么要构建基因文库为什么要构建基因文库?直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗? 哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？1）DNA序列自动测序仪：2）PCR技术： 对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。( (二二) )利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、 _、_ (_ (做启动子做启动子) )、 _._.前提条件：前提条件：原理：原理：_方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增为扩增循循 环的次数）环的次数）结果：结果：选修选修1 P1 P6060聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增( (二二) )利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因过程：过程：a a、DNADNA变性变性（90-9690-96）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火、退火（复性复性25-6525-65）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物与物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端端延伸，合成与模板互补延伸，合成与模板互补 的的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链1.1.用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。2.2.用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。( (二二) )基因表达载体的构建基因表达载体的构建 核心核心3.3.将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处， 再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒） 核心核心同一种同一种( (二二) )基因表达载体的构建基因表达载体的构建4.4.过程过程: :5.5.基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：复制原点复制原点+ +目的基因目的基因+ +启动子启动子+ +终止子终止子+ +标记基因标记基因它们有什么作用？它们有什么作用？ 常用的受体细胞：常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。母菌和动植物细胞等。 将目的基因导入受体细胞的原理将目的基因导入受体细胞的原理借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。步骤三：目的基因导入受体细胞步骤三：目的基因导入受体细胞( (三三) )将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞转化转化 方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法（1 1）农杆菌介绍）农杆菌介绍（2 2）原理及适用范围）原理及适用范围( (三三) )将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法）方法：显微注射法（2）程序：）程序：( (三三) )将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞（1）思考：为什么选用微生物作为受体细胞？）思考：为什么选用微生物作为受体细胞？（2）方法：）方法：4 4、目的基因的检测和鉴定、目的基因的检测和鉴定大量的受体细胞接受不多的目的基因。处大量的受体细胞接受不多的目的基因。处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。必须将它从中检测出来。 将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。研究。无表达产物无表达产物无表达产物无表达产物有表达产物有表达产物无表达产物无表达产物( (四四) )目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功检测检测鉴定鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交分子杂交（DNA-RNADNA-RNA杂交）杂交）抗原抗体杂交抗原抗体杂交DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。列的部位，仍然是两条游离的单链。 一、基因工程与作物育种一、基因工程与作物育种转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转鱼抗寒基转鱼抗寒基因的番茄因的番茄三、基因工程与药物研制三、基因工程与药物研制我国生产的部分基因我国生产的部分基因工程疫苗和药物工程疫苗和药物许多药品的生产许多药品的生产是从是从生物组织生物组织中提取中提取的。受材料来源限制的。受材料来源限制产量有限，其价格往产量有限，其价格往往十分昂贵。往十分昂贵。微生物生长迅速，容易控制，适于大规模微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若工业化生产。若将生物合成相应药物成分的基将生物合成相应药物成分的基因因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。人造血液及其生产人造血液及其生产我国生产的部分基因我国生产的部分基因工程疫苗和药物工程疫苗和药物白细胞介素、溶血栓剂、凝白细胞介素、溶血栓剂、凝血因子、人造血液代用品血因子、人造血液代用品疫苗：疫苗：乙肝、狂犬病、百日乙肝、狂犬病、百日咳、霍乱、伤寒、疟咳、霍乱、伤寒、疟疾疾基因工程药品基因工程药品利用基因工程培育的利用基因工程培育的“指示生物指示生物”能能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。吸收和转化污染物。 安全吗安全吗?!