微生物学综合实验报告.doc
综合实验报告书（2011 2012学年）实 验 题 目 大肠杆菌抗药性突变株的分离学院名称 生物与食品工程学院专 业 （班 级） 生物技术09-1班 姓 名 （学 号） 李顺 20096224起 讫 日 期 2011.11.26-2011.11.31指 导 教 师 李军红2011年 12 月 30 日大肠杆菌抗药性突变株的分离摘要 : 以实验室大肠杆菌为出发菌株, 采用梯度平板法, 利用链霉素, 尝试了对经紫外线诱变的菌株进行耐药性菌株的分离及抗性水平的确定。诱变前的大肠杆菌对链霉素有一定的抗性，。经过紫外诱变后,大肠杆菌对链霉素的抗药性增强，实验未能分离出纯种的抗性菌株。关键词：大肠杆菌 分离 抗药性 梯度平板法Abstrack : By the laboratory e. coli strains for starting, gradient plate method, using streptomycin, try to the strains of ultraviolet mutagenesis resistance strains on the separation and determination of the resistance level. Mutation of e. coli before to streptomycin have certain resistance,. After uv mutagenesis, escherichia coli to streptomycin resistance to strengthen, the experiment failed to separate out of the pedigree of the resistant strains.Key words : escherichia coli isolation drug- resistance Gradient plate method前言：本实验学习用梯度平板法分离抗药性突变株。实验基本原理是基因中碱基顺序的改变可导致微生物细胞的遗传变异。这种变异有时能使细胞在有害的环境中存活下来，抗药性突变就是一个例子。微生物的抗药性突变是DNA的某一特定位置的结构改变所致，与药物的存在无关，某种药物的存在只是作为分离某种抗药性菌株的一种手段，而不是作为诱发突变的诱导物。因而在含有一定浓度抑制物药物的平板上涂布大量的细胞群体，极个别抗性突变的细胞会在平板上长成菌落。将这些菌落挑取纯化，进一步进行抗性实验，就可以得到所需要的抗药性菌株。抗药性突变常用作遗传标记，因而掌握分离抗药性突变株的方法是十分必要的。为了便于选择适当的药物浓度，分离抗药性突变株常用梯度平板法。本实验拟采用梯度平板法分离大肠杆菌抗链霉素突变株。制备梯度平板的方法是：先倒入不含药物的底层培养基，把培养平板斜放，凝固后将平板平放，再倒入含有链霉素的上层培养基，这样便可得到链霉素浓度从一边到另一边逐渐降低的梯度平板。在此平板上涂布大量敏感菌，经过培养后，在链霉素浓度比较高的部位长出的菌落中可分离到抗链霉素突变株。1. 材料和方法1.1 材料1.1.1 菌种 大肠杆菌，由微生物综合实验室提供。1.1.2 培养基和试剂 LB培养基，生理盐水，无菌水，链霉素。1.2 方法1.2.1 菌体培养：接种大肠杆菌于盛有LB培养基的试管斜面上，37培养24h。1.2.2 菌悬液的制备：将上述试管斜面中加入适量的无菌生理盐水，用接种环刮去斜面上菌体，震荡摇匀制成菌悬液。1.2.3 梯度平皿的制备：在热水浴中溶化LB琼脂培养基。倒10ml已溶化的不含药物的LB琼脂培养基于一套无菌培养皿中，立即将培养皿一端垫起，使琼脂培养基覆盖整个底部并使培养基表面在垫起的一端刚好达到培养皿的底与边的交界处，让培养基在这一倾斜的位置凝固。在已凝固的平板底部高琼脂这一边标上“低”，并放回水平位置，然后在底层培养基上加入每毫升含有100g/ ml的梯度平板（如图）。1.2.4 紫外线诱变：将紫外灯（15W）打开预热20min取直径6cm无菌平皿3套，分别加入上述3个稀释度的菌液3mL。将上述3套平皿置于紫外灯下，打开皿盖，在垂直距离为30cm处照射2min,3min,4min,5min。盖上皿盖，关闭紫外灯1.2.5 诱变后抗药性及分离抗性突变株制备不含药物的LB培养基.制备每毫升含有100µg链霉素的LB培养基. 在上述诱变过程中，同样地每照射一次后从每套平皿的菌液中，取0.1mL，涂布于梯度平板上，把平板倒置在37下避光培养24h，记录菌落生长状况,分离出生长较好的菌株.培养24h1.2.6 诱变菌株扩大培养：将上述诱变后的菌体接种到含LB培养基的试管斜面上，37培养24h。1.2.7 诱变菌株菌悬液的制备：将上述诱变后的菌体试管中加入适量的无菌生理盐水，用接种环刮去斜面上菌体，震荡摇匀制成菌悬液。1.2.8 用1ml无菌吸管各吸取0.2ml不同处理的大肠杆菌培养液加到梯度平板上。用无菌玻璃棒将菌液涂布到整个平板表面。如果用蘸有乙醇并经火焰灭菌的玻璃涂棒，可在火焰旁伸进平板，在板盖上稍微冷却，以免烫死细胞。把平板倒置于37温箱中培养24h。观察结果。2. 结果与分析2.1 大肠杆菌诱变后生长状况：（因照射后菌体生长过于不明显，就未拍下图片，请老师见谅）实验结果表明照射时间越长，抗药性突变越少。第一次照射时间计划为一分钟，但实际上照射了二分钟。故认为二分钟照射为抗药性诱变最佳时间。2.2 接种梯度平板分离结果： 从上到下一次为正常、照射二分钟、三分钟、四分钟、五分钟因菌落生长过于浅显并且菌体生长较少，所以从图上只能看到照射三分钟的培养基上有菌体生长。用肉眼观察可知，照射二分钟上的平皿上也有菌落生长但菌落生长稀疏且覆盖整个培养基。照射四分钟与五分钟上菌落几乎没有生长。没有经过照射的正常培养基上也几乎没有生长。所以总体来说并没有分离出抗药性突变菌株。可能原因是1制备梯度平平皿时间过长，平皿中药物浓度均匀化，致使梯度平皿没有起到梯度分离的作用。2接种到培养基上的菌体太少。菌体接种不均匀等等操作失误导致实验结果不理想。3. 结果与讨论（包括体会）不实验结果不理想，没有达到预期的分离出突变株的目的，但从实验中，我们得到了一些结论：1大肠杆菌自然条件下对链霉素具有一定的抗药性；2紫外线诱变时间越长大肠杆菌抗药性突变越少，致死率越高。我们学到：1梯度平板法分离抗药性突变株；2实验的基本原理；3自己制定实验方案，自己完成实验，提高了动手能力、交流能力、文献查询能力等。致谢： 感谢李军红老师在实验过程中给予我们无私的帮助与鼓励，特别是在实验过程中给予我们正确的指导，让我们省去了很多疑问。 感谢李延红老师在实验过程中帮助我们准备实验材料与仪器，并指导我们如何正确使用实验仪器。 感谢刘佳林、张凤、苏永斌等同学给予的实验上的合作与帮助。参考文献：1刘玉庆.用线性梯度平板准确测定药物敏感性和分离抗药性菌株J.中国科学：生命科学，2011，（09)2郭素芳，王光.168株大肠杆菌对8种抗生素耐药性分析J.内蒙古医学杂志,2005,(02)3沈平,李广武.微生物学实验J.高等教育出版社，1999，（06）4叶明.微生物实验技术J.合肥工业大学出版社，2009，（08）5叶明.微生物学J.化学工业出版社，2010，（04）合肥工业大学综合实验报告综合实验审阅成绩评定书 学生姓名李顺专业(班级)生物技术学号20096224 实验名称：大肠杆菌抗药性突变株的分离个人小结：1熟练了微生物操作技术，学习了梯度平板分离菌体的方法2提高了合作能力与交流能力3本实验实验结果不理想与个人操作、实验环境、药品试剂等均有关系4在以后的实验中应努力提高自己实验操作技术，严格制定实验方案。个人签名：李顺年 月 日成绩：指导教师签字：年 月 日
