植物细胞工程实验指导.docx

植物细胞工程实验指导实验一植物组织培养培养基的配制【实验目的】通过实验，把握常用MS培养基的配制。【仪器及试剂】1仪器：500ml试剂瓶4个，100ml试剂瓶4个，高压灭菌锅，电子天平，烧杯大、中、小各2个，玻璃棒，移液管，搪瓷缸，培养瓶，电炉，pH计或精细pH试纸，容量瓶大、中、小各1个2试剂：见MS培养基的配制方法一览表【操作步骤】1、母液的配制：为了避免每次配制培养基时都要对所需的各种成分进行称量，人们便把培养基中必需的一些物质按原量的10倍、100倍或1000倍称量后放在一起，成为一种浓缩液，这种浓缩液就叫“母液。大量元素：一般配成使用浓度的1020倍，浓度太大的母液在冰箱保存时会结晶。除钙盐外，其它大量元素按一定倍数分别称量并分别用蒸馏水溶解后混合在一起，最后加蒸馏水定容。钙盐要单独配制，不能和PO43-、SO42-混合，以免生成Ca3(PO4)2或CaSO4，发生沉淀。微量元素：微量元素因用量小，为称量方便及准确起见常配成100倍或1000倍的母液，即每种化合物的量加大100倍或1000倍，逐个溶解并混合在一起。铁盐：微量元素中的铁盐是单独配制的，由硫酸亚铁FeSO4·7H2O5.56克和乙二铵四乙酸二钠Na2-EDTA7.46克溶于1升水中配成。每配1升培养基加铁盐5毫升。有机物质：主要指氨基酸和维生素物质，它们都是分别称量及分别用容量瓶配成所需浓度0.110毫克/毫升，用时按培养基配方中要求的量分别参加。这些化合物都易溶于水，直接用水配制。生长调节物质：一般配成0.11.0毫克/毫升。生长素类IAA、NAA、2,4-D等，配制时先按要求浓度称好药品，置于小烧杯中，用12毫升0.1N氢氧化钠溶解，再加蒸馏水稀释至所需浓度。假如用少量95的乙醇来溶解亦可，有时效果不如氢氧化钠好。配制细胞分裂素类物质时，则宜先用少量0.5N或1N盐酸来溶解，然后加蒸馏水至所需量。2、配制培养基汲取各种母液，按培养基配方汲取一定量的各种母液混合在一起。大量及微量元素的母液汲取量为：母液汲取量ml=配制培养基的数量ml/母液扩大倍数有机物及生长调节物质的母液汲取量为：母液汲取量ml=每升培养基要求的含量mg/每毫升母液中的含量mg称取一定量的蔗糖或葡萄糖等，溶解后与1混合。称取一定量的琼脂，加蒸馏水，加热使其熔化成透明状后，和1合并。用热蒸馏水定容到一定体积，继续加热，不断搅拌，直至琼脂完全溶解。用pH计或精细pH试纸测pH值，用1N或0.1N氢氧化钠或盐酸将培养基的pH值调至5.86.0。将配好的培养基用漏斗或分装器分装到干净的培养瓶内。琼脂约在40时才凝固，所以有足够的时间来进行分装工作。用封口膜封口，并对不同的培养基及时做好标记。3、灭菌通常培养基应在汽相120的条件下在高压锅内灭菌20分钟。在高压灭菌锅的加热经过中，在气压指针上升到0.5公斤/厘米2时，放一次气，然后在温度达120、1.1公斤/厘米2时，保持此压力灭菌1520分钟。灭菌完成后，待灭菌锅的压力0降到时，打开灭菌锅，取出培养瓶，放平，待培养基凝固后备用。【注意事项】1实验中所用的各种容器一定要洗净、烘干。2用电子天平称量药品时，一定要用称量纸，对于有腐蚀性的药品，应将其放在小烧杯中称量。3各种母液应保存在24的冰箱中，以免变质、长霉。4吲哆乙酸IAA受热不稳定，所以不能和培养基一起灭菌，要过滤除菌。5用高压灭菌锅时，一定要先检查一下其中的水能否适宜。实验二植物叶片的脱分化和再分化培养【实验原理】分化了的植物叶片细胞往往具有全能性，在一定条件下进行离体培养，给于一定的营养与激素，能够脱分化为愈伤组织，由愈伤组织在一定的条件下逐步构成具有两极性的胚状体，经过进一步的分化培养，给于不同的营养与激素成分，又能够生出完好的小植株。【实验目的】通过实验，把握无菌操作方法，将烟草叶片培养成愈伤组织；将愈伤组织分化成幼苗。【仪器、材料及试剂】1.仪器：超净工作台，无菌滤纸、剪刀、镊子、大培养皿、无菌烧杯2.材料：烟草无菌苗和室外培养的烟草幼苗3.试剂：70%的乙醇，0.1%的升汞，无菌水【操作步骤】1.操作前用温水和肥皂将手充分擦洗干净，再用70%的乙醇消毒，尽量做到不带菌。2.将装有无菌苗的培养瓶用70的乙醇消毒后放在超净工作台上备用；将室外培养的烟草先用自来水洗净后，再用70的乙醇消毒12秒钟，再于0.1%的升汞中消毒510分钟。再于无菌条件下用无菌水冲洗45遍，用无菌滤纸吸干后备用。3.接种，将上述材料在无菌条件下剪成0.5cm×0.5cm大小，接种于诱导培养基MSBA1.0NAA0.1中诱导愈伤组织，在此培养基上能诱导出愈伤组织并能长出小芽。4.状苗生根培养，将3中培养的带有愈伤组织的小芽接种在MS基本培养基中，芽能长成幼苗并且能生根。【注意事项】1操作前要洗手，进入超净工作台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。2点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上炙烤，金属器械炙烤后，要冷却后才能夹取组织，以免烧焦组织。3不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。4注意升汞是剧毒药品，一定不要直接用手接触，用完后要放在回收的容器中，不能直接倒入下水道中。【实验报告】观察并记录接种的烟草脱分化的情况。【考虑题】1.接种的烟草组织有无污染？为何？2.愈伤组织细胞能否出现绿色？讨论其;与影响？3.烟草组织经过分化培养、长出完好的植株，讲明什么问题？在理论和实践中有何价值？实验三玉米成熟胚的培养【实验原理】成熟胚一般指子叶期后至发育完全的胚，它培养极易成功。在含有无机大量元素和糖的培养基上，就能培养成幼苗。【实验目的】1.把握胚培养的方法2.了解在种子萌发经过中胚各部分之间的互作，以及胚的各个组成部分的形态发生潜力。【仪器、材料及试剂】1仪器：超净工作台，无菌滤纸、解剖刀、镊子、无菌培养皿、解剖镜、培养瓶。2材料：成熟玉米种子3试剂：70%的乙醇，0.1%的升汞，无菌水【操作步骤】1.成熟玉米种子的消毒及浸泡：玉米种子用70的乙醇消毒35分钟，再于0.1%的升汞中消毒1015分钟。再在无菌条件下用无菌水冲洗45遍，用无菌滤纸吸干后放于盛有无菌水的培养瓶中，封口，浸泡2-3天，备用。2.于无菌条件下，在解剖镜下，用镊子、解剖刀剥取完全的胚，将胚放在01.%的升汞中消毒1分钟，再用无菌水冲净后接种培养。3.在无菌条件下，将完好的胚切去一部分后，再在01.%的升汞中消毒1分钟，再用无菌水冲净后接种培养。【注意事项】1操作前要洗手，进入超净工作台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。2消毒的玉米种子要始终处于无菌的条件下。3点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上炙烤，金属器械炙烤后，要冷却后才能夹取组织，以免烧焦组织。4不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。5注意升汞是剧毒药品，一定不要直接用手接触，用完后要放在回收的容器中，不能直接倒入下水道中。【实验报告】1.观察并记录完好玉米种子的出苗情况。2.观察并记录残缺玉米种子的出苗情况，去掉一部分后对其发芽能力及幼苗生长的情况有何影响？实验四月季快繁【实验原理】月季的某些珍贵品种，用传统的无性繁衍法速度太慢，难以知足人们日益增长和美化环境的需要。而采用快繁则解决了这种问题。快繁是由单芽诱导丛生芽，再诱导丛生芽生根，从尔大大提高了繁衍的速度。【实验目的】了解木本观赏植物的快繁技术【仪器、材料及试剂】1仪器：培养瓶、超净工作台，剪刀、镊子、大烧杯、无菌培养皿、无菌滤纸2材料：当年生幼嫩月季枝条3试剂：70%乙醇，0.1%升汞无菌水【操作步骤】1.取具腋芽的月季嫩茎，先用自来水冲净，再用70%乙醇消毒12秒钟，然后置于0.1%升汞中消毒10分钟左右，再于超净工作台