课题1DNA的粗提取与鉴定.ppt

在在NaClNaCl溶液浓度低于溶液浓度低于0.14 0.14 mol/Lmol/L时，时，DNADNA的溶解度随的溶解度随NaClNaCl溶液浓度的增加而逐渐溶液浓度的增加而逐渐降低；在降低；在0.14 mol/L0.14 mol/L时，时，DNADNA溶解度最小；当溶解度最小；当NaClNaCl溶溶液浓度继续增加时，液浓度继续增加时，DNADNA的的溶解度又逐渐增大。溶解度又逐渐增大。当氯化钠的物质的量浓度为当氯化钠的物质的量浓度为 2 mol2 molL L时，时，DNADNA的溶解度的溶解度最大，浓度为最大，浓度为 0 014 mol14 molL L时，时，DNADNA的溶解度最低。利的溶解度最低。利用这一原理，可以使用这一原理，可以使DNADNA在在盐溶液中溶解或析出盐溶液中溶解或析出DNA的鉴定DNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定实验原理实验原理DNA在不同浓度在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同溶液中溶解度不同DNA与其他细胞成分在酒精中溶解度不同与其他细胞成分在酒精中溶解度不同DNA和蛋白质对酶、高温和洗涤剂耐受性不同和蛋白质对酶、高温和洗涤剂耐受性不同DNA与二苯胺呈现蓝色反应与二苯胺呈现蓝色反应DNA粗提取粗提取选择适宜材料选择适宜材料破碎细胞破碎细胞DNA的溶解和析出的溶解和析出DNA的纯化的纯化鉴定鉴定DNA与二苯胺混合，沸水浴，呈现蓝色反应与二苯胺混合，沸水浴，呈现蓝色反应方法步骤方法步骤 加入物质加入物质 目的目的 1.制备鸡血细胞液 柠檬酸钠溶液 2.提取鸡血细胞细胞核物质 20 m1蒸馏水 3.溶解细胞核内的DNA 2 mo1 L 的 NaCl 溶液 40 mL 4.析出含DNA 的黏稠物 蒸馏水 5.滤取含DNA 的黏稠物 6.将DNA 的黏稠物再溶解 2 molL 的NaCl溶液20 mL 7.过滤含DNA 的NaCl 溶液 8.提取含有杂质较少的DNA 冷却的95的酒精50 mL A:(1)向试管中加入2molL 的NaCl溶液5mL (2)加入DNA (3)4 mL二苯胺试剂 9.DNA的鉴定 B:(1)向试管中加入 2mol L 的NaCl溶液5mL (2)4 mL 二苯胺试剂 加入柠檬酸钠溶液的目的是防止血凝固加入柠檬酸钠溶液的目的是防止血凝固加速血细胞破裂加速血细胞破裂 溶解溶解DNA 使使2mol/L的的NaCl溶液稀释至溶液稀释至0.14mol/L使得使得DNA最大限度地释出最大限度地释出 使含使含DNA的黏稠物被留在纱布上的黏稠物被留在纱布上使含使含DNA的黏稠物尽可能多的溶解于溶液中的黏稠物尽可能多的溶解于溶液中除去含除去含DNA的滤液中的杂质的滤液中的杂质提取提取DNA A出现蓝色出现蓝色 B无变化无变化DNADNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定一、实验原理一、实验原理 1.1.血细胞在蒸馏水中会渗透吸水过度而导致细胞膜和细血细胞在蒸馏水中会渗透吸水过度而导致细胞膜和细胞核膜的破裂。利用此特性可得到含有胞核膜的破裂。利用此特性可得到含有DNA的溶液。的溶液。2.2.DNA在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氯化钠的浓度在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氯化钠的浓度的变化而改变的。的变化而改变的。DNA在在物质的量浓度为物质的量浓度为0.14 molL的氯化钠溶液中的溶解度最低，的氯化钠溶液中的溶解度最低，利用这一原理，可以使利用这一原理，可以使溶解在氯化钠溶液中的溶解在氯化钠溶液中的DNA析出析出。 3.3.DNA不溶于酒精溶液不溶于酒精溶液，但细胞中的但细胞中的某些物质则可以溶某些物质则可以溶于酒精。于酒精。利用这一原理，可以进一步利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少提取出含杂质较少的的DNA。 4.4.DNA遇二苯胺（沸水浴）会变成蓝色，因此，遇二苯胺（沸水浴）会变成蓝色，因此，二苯胺二苯胺可以作为鉴定可以作为鉴定DNA的试剂的试剂。 二、方法与过程二、方法与过程 1.1.制鸡血细胞液制鸡血细胞液（活鸡鲜血经分离或沉淀获得）（活鸡鲜血经分离或沉淀获得）0.1g/mL柠檬酸钠柠檬酸钠100mL活鸡鲜血活鸡鲜血180mL500mL烧杯中，玻棒烧杯中，玻棒搅拌搅拌，离心、分离或静置沉淀。离心、分离或静置沉淀。2.提取提取DNA取血细胞取血细胞5-10mL20mL蒸馏水，用玻棒沿一个方向蒸馏水，用玻棒沿一个方向快速搅拌快速搅拌。纱布纱布过滤过滤：滤液中含：滤液中含DNA和其他核物质，如蛋白质。和其他核物质，如蛋白质。原理：血细胞的细胞膜、核摸吸水胀破，玻璃棒原理：血细胞的细胞膜、核摸吸水胀破，玻璃棒快速快速搅拌搅拌，机械加速血细胞破裂。，机械加速血细胞破裂。.提取提取血血细胞核物质：细胞核物质：.溶解核内的溶解核内的DNA： 滤液滤液2mol/L的的NaCl溶液溶液40mL，玻棒沿一个方向，玻棒沿一个方向轻缓搅拌轻缓搅拌。.析出析出含含DNA的粘稠物：的粘稠物：.滤取含滤取含DNA的粘稠物：的粘稠物：. DNA粘稠物的再溶解：粘稠物的再溶解： 在上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并沿一个方向在上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并沿一个方向轻轻轻搅拌轻搅拌，出现丝状物；当丝状物不在增加时，停止加，出现丝状物；当丝状物不在增加时，停止加水（此时水（此时NaCl溶液的浓度相当于溶液的浓度相当于0.14mol/L）。）。 用多层纱布用多层纱布过滤过滤，含，含DNA的粘稠物留在纱布上。的粘稠物留在纱布上。 20mL 2mol/L的的NaCl溶液溶液步骤步骤含含DNA的粘稠物的粘稠物在20mL烧杯中烧杯中轻缓搅拌轻缓搅拌3min，使尽可能多的，使尽可能多的DNA溶解在溶解在NaCl溶液溶液。.过滤含有过滤含有DNA的的NaCl溶液：溶液： 用放有两层纱布的漏斗用放有两层纱布的漏斗过滤过滤步骤步骤所得的溶液，所得的溶液，滤液中含有滤液中含有DNA。.提取含有杂质较少的提取含有杂质较少的DNA： 步骤步骤所得的滤液体积分数为所得的滤液体积分数为95%的冷却酒精的冷却酒精50mL，用玻棒沿一个方向，用玻棒沿一个方向轻缓搅拌轻缓搅拌，溶液中（，溶液中（析出析出）出现乳白色丝状物，用玻棒将丝状物卷起，并用滤纸出现乳白色丝状物，用玻棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。吸取上面的水分。3.DNA的鉴定：的鉴定： 加入二苯胺试剂加入二苯胺试剂4mL，用玻棒，用玻棒搅拌搅拌使使DNA溶解，溶解，沸水浴沸水浴5min，观察溶液是否出现蓝色。，观察溶液是否出现蓝色。1.共有共有“三次过滤，两次析出，七次搅拌三次过滤，两次析出，七次搅拌”2.加入加入“两次蒸馏水，两次蒸馏水，三次三次NaCl溶液，一次酒精，一次酒精”三、实验小结三、实验小结练习练习1、请解释提取、请解释提取DNA的实验操作中主要的步骤的目的。的实验操作中主要的步骤的目的。答：提取答：提取DNA的第一步是材料的选取，其目的的第一步是材料的选取，其目的是一定要选取是一定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；第二步是第二步是DNA的释放和溶解，这一步是实验成功的释放和溶解，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的与否的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解；全部溶解；第三步是第三步是DNA的纯化，即根据的纯化，即根据DNA的溶解特性、的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开；最后一步是对与杂质分开；最后一步是对DNA进行鉴定，进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。这是对整个实验的结果的检测。2、你认为从细胞中提取某种特定的蛋白质、你认为从细胞中提取某种特定的蛋白质与提取与提取DNA一样容易吗？一样容易吗？答：提取蛋白质比提取答：提取蛋白质比提取DNA的难度大。这的难度大。这是因为，与是因为，与DNA相比，蛋白质对温度、盐相比，蛋白质对温度、盐浓度、浓度、pH等条件要敏感得多，很容易失活；等条件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取没有一种质各不相同，使得蛋白质的提取没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质的特性统一的方法，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。摸索提取的条件，设计特定的方法。2.实验中实验中NaCl的物质的量浓度为的物质的量浓度为2 molL和和0.14 molL对对DNA有何影响有何影响?1.在在DNA的粗提取实验过程中，两次向烧杯的粗提取实验过程中，两次向烧杯中加入蒸馏水的作用是中加入蒸馏水的作用是( )。A.稀释血液、冲洗样品稀释血液、冲洗样品B.使血细胞破裂、降低使血细胞破裂、降低NaCl浓度使浓度使DNA析出析出C.使血细胞破裂、增大使血细胞破裂、增大DNA溶解量溶解量 D.使血细胞破裂、提取含杂质较少的使血细胞破裂、提取含杂质较少的DNAB答：答：前者是溶解前者是溶解DNA，后者是使，后者是使DNA析出析出3.DNA3.DNA遇二苯胺遇二苯胺( (沸水浴沸水浴) )会染成会染成( ) ( ) A. A.砖红色砖红色 B.B.橘黄色橘黄色 C.C.紫色紫色 D.D.蓝色蓝色4.提取鸡血中的提取鸡血中的DNA时，为什么要除去血液时，为什么要除去血液中的上清液中的上清液?答：答：DNA的提取，关键是对杂质的去除，由于的提取，关键是对杂质的去除，由于上清液是血液中的血浆部分，不含上清液是血液中的血浆部分，不含DNA，所以，所以要除去上清液要除去上清液(含有蛋白质含有蛋白质)。D