生物化学--酶化学PPT课件.ppt

酶酶 化化 学学 (Chemistry of Enzyme) (Chemistry of Enzyme)本章重点及难点本章重点及难点重点：重点：了解酶作为生物催化剂的特点、国际命名；了解酶催化作用机理 ；掌握酶促反应动力学中米氏方程及Km的意义、应用，掌握影响酶促反应动力学的因素及与影响酶催化高效性的因素之间的区别。掌握别构酶的特点及核酶、同工酶、诱导酶等的概念。难点：难点：酶催化作用机理 、各因素对酶促反应速度的影响及酶促反应动力学的应用。第一节第一节 通通 论论一、酶学研究历史一、酶学研究历史n公元前两千多年，我国已有酿酒记载。公元前两千多年，我国已有酿酒记载。n一百余年前，一百余年前，Pasteur认为发酵是酵母细胞生命活动的认为发酵是酵母细胞生命活动的结果。结果。n1877年，年，Kuhne首次提出首次提出Enzyme一词。一词。n1897年，年，Buchner兄弟用不含细胞的酵母提取液，实兄弟用不含细胞的酵母提取液，实现了发酵。现了发酵。n1926年，年，Sumner首次从刀豆中提纯出脲酶结晶。首次从刀豆中提纯出脲酶结晶。n1982年，年，Cech首次发现首次发现RNA也具有酶的催化活性，也具有酶的催化活性，提出提出核酶核酶(ribozyme)的概念。的概念。n1995年，年，Jack W. Szostak研究室首先报道了具有研究室首先报道了具有D N A 连 接 酶 活 性连 接 酶 活 性 D N A 片 段 ， 称 为片 段 ， 称 为 脱 氧 核 酶脱 氧 核 酶(deoxyribozyme)。 二、什么是酶？二、什么是酶？ 酶是由活细胞产生的，能在体内或体外起同样催化作用酶是由活细胞产生的，能在体内或体外起同样催化作用的一类具有活性中心和特殊构象的生物大分子，包括蛋白质的一类具有活性中心和特殊构象的生物大分子，包括蛋白质和核酸，是生物催化剂。和核酸，是生物催化剂。 三、酶与一般催化剂的共性及特性三、酶与一般催化剂的共性及特性 1、共性、共性（1）不发生质、量的变化，但能）不发生质、量的变化，但能 改变反应速度改变反应速度（2）不改变反应的平衡点，但能）不改变反应的平衡点，但能 缩短反应时。缩短反应时。（3）可降低反应活化能）可降低反应活化能（4）只能催化热力学允许的反应）只能催化热力学允许的反应 2、个性、个性（1）极高的催化效率）极高的催化效率（2）高度专一性）高度专一性（3）易失活）易失活（4）酶活性可调控）酶活性可调控（5）催化作用与结构有关）催化作用与结构有关 酶专一性类型酶专一性类型1. 结构专一性结构专一性 酶对所催化的分子（底物，酶对所催化的分子（底物，Substrate）化学结）化学结构的特殊要求和选择构的特殊要求和选择 类别：绝对专一性和相对专一性类别：绝对专一性和相对专一性2. 立体异构专一性立体异构专一性 酶除了对底物分子的化学结构有要求外，对其酶除了对底物分子的化学结构有要求外，对其立体异构也有一定的要求立体异构也有一定的要求 类别：旋光异构专一性和几何异构专一性类别：旋光异构专一性和几何异构专一性四、酶作用专一性的四、酶作用专一性的假说假说(1)、锁钥学说、锁钥学说（模板学说）（模板学说） (2)、多位点亲和理论、多位点亲和理论(3)、诱导契合学说、诱导契合学说(3)、诱导契合学说、诱导契合学说五、酶的命名和分类五、酶的命名和分类1. 命名：命名：习惯命名；系统命名习惯命名；系统命名2. 国际系统分类法及编号国际系统分类法及编号 *国际生物化学会酶学委员会（国际生物化学会酶学委员会（Enzyme Commsion）将酶）将酶分成六大类：分成六大类：1.氧化还原酶类氧化还原酶类，2.转移酶类转移酶类，3.水解酶类水解酶类，4.裂裂解酶类解酶类，5.异构酶类异构酶类，6.合成酶类合成酶类 * 每一种酶有一个编号每一种酶有一个编号,如乙醇脱氢酶如乙醇脱氢酶 EC 1. 1. 1. 27 大类大类 亚类亚类 亚亚类亚亚类 序号序号 第二节第二节 酶的分子结构与功能酶的分子结构与功能酶酶简单酶简单酶：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等。：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等。 结合酶结合酶酶蛋白酶蛋白辅助因子辅助因子（简单蛋白质简单蛋白质）（结合蛋白质）（结合蛋白质）（apoenzymeapoenzyme）（cofacter)cofacter)辅酶辅酶（coenzyme)coenzyme)辅基辅基(prosthetic group)(prosthetic group)全酶全酶(holoenzyme(holoenzyme）= = 酶蛋白酶蛋白 + + 辅助因子辅助因子一、酶的组成一、酶的组成* *各部分成分在催化反应中的作用各部分成分在催化反应中的作用q酶蛋白决定反应的专一性酶蛋白决定反应的专一性q辅助因子决定反应的种类与性质辅助因子决定反应的种类与性质 金属酶金属酶(metalloenzyme)金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢失。失。 金属激活酶金属激活酶(metal-activated enzyme) 金属离子为酶的活性所必需，但与酶的结合金属离子为酶的活性所必需，但与酶的结合不甚紧密。不甚紧密。 辅助因子分类辅助因子分类（按其与酶蛋白结合的紧密程度）（按其与酶蛋白结合的紧密程度） 辅酶辅酶 (coenzyme):与酶蛋白结合与酶蛋白结合疏松，可用疏松，可用透析或超滤的透析或超滤的方法除去。方法除去。 辅基辅基 (prosthetic group):与酶蛋白结合与酶蛋白结合紧密，不能用紧密，不能用透析或超透析或超滤的方法除去滤的方法除去。或称活性部位或称活性部位，酶分子中直接和底物结酶分子中直接和底物结合并起催化反应的空间局限（部位）。合并起催化反应的空间局限（部位）。1. 酶的活性中心酶的活性中心（催化部位）催化部位）二、酶分子的结构特征二、酶分子的结构特征结合部位决定酶的专一性催化部位催化部位 酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位，催化部位决定酶所催化反应的性质。 活性中心的特点活性中心的特点n 活性部位只占酶整个分子很小部分。通常只有几个活性部位只占酶整个分子很小部分。通常只有几个aaaa残基组成。残基组成。n 酶的活性中心是个三维实体，是在酶的高级结构中形成的，酶的活酶的活性中心是个三维实体，是在酶的高级结构中形成的，酶的活 性中心的性中心的aaaa残基在一级结构可能相距很远，但在空间结构上十分靠残基在一级结构可能相距很远，但在空间结构上十分靠 近。近。n 酶与底物的结合是活性部分与底物的形状发生诱导锲合的过程。酶与底物的结合是活性部分与底物的形状发生诱导锲合的过程。n 酶的活性部位位于酶分子表面的一个裂缝内，底物分子就结合到这酶的活性部位位于酶分子表面的一个裂缝内，底物分子就结合到这 个裂缝内，裂缝内含较多疏水基团，有利于结合催化。个裂缝内，裂缝内含较多疏水基团，有利于结合催化。n 酶活性中心是可运动性的，酶活性中心与底物的结合通过次级键。酶活性中心是可运动性的，酶活性中心与底物的结合通过次级键。AspHisSer胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶的的活活性性中中心心活性中心重要基团活性中心重要基团: His57 , Asp102 , Ser195 2. 2. 必需基团必需基团指酶表现催化活性不可缺少的基团，指在活指酶表现催化活性不可缺少的基团，指在活性中心之外的某些区域，不与底物直接作用。性中心之外的某些区域，不与底物直接作用。 底底 物物 活性中心以外活性中心以外的必需基团的必需基团结合基团结合基团催化基团催化基团 活性中心活性中心 三、与酶的高效率有关的主要因素（策略）三、与酶的高效率有关的主要因素（策略） 1、 邻近与定向效应邻近与定向效应 2、 诱导契合与底物扭曲变形诱导契合与底物扭曲变形 3、 共价催化共价催化 4、 酸碱催化酸碱催化 5、微环境影响、微环境影响酶分子中可作为亲核基团和酸碱催化的功能基团酶分子中可作为亲核基团和酸碱催化的功能基团胰凝乳蛋白酶反应的详细机制（胰凝乳蛋白酶反应的详细机制（1）结合底物结合底物His57 质子供体质子供体形成共价形成共价ES复合物复合物C-N键断裂键断裂底物底物胰凝乳蛋白酶反应的详细机制（胰凝乳蛋白酶反应的详细机制（2）羰基产物释放羰基产物释放四面体中间物四面体中间物的瓦解的瓦解水亲核攻击水亲核攻击羧基产物释放羧基产物释放第三节第三节酶促反应的动力学酶促反应的动力学本节需要解决的问题n底物浓度与酶促反应速度的影响n酶浓度对酶促反应速度的影响npH对酶促反应速度的影响n温度对酶促反应速度的影响n激活剂对酶促反应速度的影响n抑制剂对酶促反应速度的影响一、底物浓度对反应速度的影响一、底物浓度对反应速度的影响（一）、曲线的基本含义（一）、曲线的基本含义I.单底物、单产物反应单底物、单产物反应II.酶促反应速度一般在规定的反应条件下，酶促反应速度一般在规定的反应条件下，用用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示表示III.反应速度取其初速度，即底物的消耗量很小反应速度取其初速度，即底物的消耗量很小（一般在（一般在5以内）时的反应速度以内）时的反应速度IV.底物浓度远远大于酶浓度底物浓度远远大于酶浓度v在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速 度的影响呈矩形双曲线关系。度的影响呈矩形双曲线关系。当底物浓度较低时当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比；反反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。应为一级反应。随着底物浓度的增高随着底物浓度的增高反应速度不再成正比例加速；反应反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。为混合级反应。当底物浓度高达一定程度当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加，达最大速度；反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应反应为零级反应。（二）米氏方程式（二）米氏方程式中间产物中间产物1.1.快速平衡理论与稳态平衡理论快速平衡理论与稳态平衡理论E + S k1k2k3ESE + P 快速平衡理论快速平衡理论 19131913年年 MichaelisMichaelis和和Meuten Meuten 提出，当底物浓度远远大于酶浓度时，假提出，当底物浓度远远大于酶浓度时，假定定ESES分解成产物的逆反应可忽略不计，因此在分解成产物的逆反应可忽略不计，因此在“快速平衡快速平衡”理论的基础上理论的基础上推倒出一个数学方程式，以表示底物浓度与酶反应速率之间的定量关系，推倒出一个数学方程式，以表示底物浓度与酶反应速率之间的定量关系，称为米氏方程。称为米氏方程。 稳态平衡理论稳态平衡理论 19251925年年BriggsBriggs和和HaldaneHaldane提出，反应进行一段时间后，提出，反应进行一段时间后，ESES浓度增加到一浓度增加到一定值时，定值时，ESES也在不断分解，只有当也在不断分解，只有当ESES的生成速度与分解速度相等时，的生成速度与分解速度相等时，ESES的的浓度才保持不变，并对米化方程进行了修正，但为纪念仍称米氏方程。浓度才保持不变，并对米化方程进行了修正，但为纪念仍称米氏方程。什么是米氏方程式？什么是米氏方程式？ 快速平衡理论的基础上快速平衡理论的基础上BriggsBriggs和和HaldaneHaldane在在稳态平衡理稳态平衡理论的基础上论的基础上并对米化方程进行了修正，但为纪念仍称米氏方程并对米化方程进行了修正，但为纪念仍称米氏方程S：底物浓度：底物浓度 V ：反应速度：反应速度 Vmax：最大反应速度：最大反应速度m：米氏常数：米氏常数V=Vmax SKm + S米米氏氏方方程程的的推推导导 121kkkESSESSEt令令：Kmkkk121将将（4）代入代入（3），则，则： SKSVvmmax1kES 1kES2kEP ESEt SESES生成速度生成速度： SESEkvt11，ES分解速度分解速度：ESkESkv212即即： ESkESkSESEkt211则则： SSESESKmtE(1)经整理得经整理得： SKSEmtES由于酶促反应速度由由于酶促反应速度由ES决定，即决定，即ESkv22kvES，所以所以(2)将将（2）代入代入（1）得得： SKSEkvmt2 SKSEkmt2v(3)当酶反应体系处于当酶反应体系处于稳态稳态时时：21vv 当当Et=ES时时，mVv tmEkV2(4)所以所以 KmS * Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是时的底物浓度，单位是mol/L。2Km + S Vmax VmaxSKm的意义的意义 Km值值 Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。浓度。 意义：意义：a) Km是酶的特征性常数之一；是酶的特征性常数之一；b) Km可表示酶对底物的亲和力；可表示酶对底物的亲和力；c) 同一酶对于不同底物有不同的同一酶对于不同底物有不同的Km值。值。 Vmax的意义的意义定义：定义：Vmax是酶完全被底物饱和时的反应速度，是酶完全被底物饱和时的反应速度， 与酶浓度成正比。与酶浓度成正比。 意义：意义：Vmax=K3 E 如果酶的总浓度已知，可从如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算计算 酶酶 的转换数的转换数，即动力学常数，即动力学常数K3。1 1 K Km 1 1m 1 1 = = + + V V V Vmax S max S V Vmaxmax-4-202468100.00.20.40.60.81.01/S(1/mmol.L-1)1/v1/Vmax斜率斜率=Km/Vmax-1/Km3.3.米氏常数米氏常数KmKm的测定的测定二、酶浓度对酶促反应速度的影响二、酶浓度对酶促反应速度的影响 当当SE，酶可被底物饱和的情，酶可被底物饱和的情况下，反应速度与酶浓度成正比关系况下，反应速度与酶浓度成正比关系式为：式为：V = K3 E三、温度对酶促反应速度的影响三、温度对酶促反应速度的影响(1)(1)、一方面是温度升高、一方面是温度升高, ,酶促酶促 反应速度加快；反应速度加快；(2)(2)、另一方面、另一方面, ,温度升高温度升高, ,酶的酶的 高级结构将发生变化或变性，高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失；导致酶活性降低甚至丧失； (3)(3)、因此大多数酶都有一个最、因此大多数酶都有一个最 适温度。适温度。 在最适温度条件在最适温度条件 下下, ,酶促反应速度最大。酶促反应速度最大。102030405060708090020406080100Temperature OCRelative Activity (%)四四、pH对酶促反应速度的影响对酶促反应速度的影响五、激活剂五、激活剂对酶作用的影响对酶作用的影响 金属离子：金属离子：K+、Na+、 Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Se3+ 、 Co2+、Fe2+ 阴离子：阴离子： Cl-、Br- 有机分子有机分子 还原剂：抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽还原剂：抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽 金属螯合剂：金属螯合剂：EDTA定义：凡是能提高酶活性的物质，称为酶的激活剂。定义：凡是能提高酶活性的物质，称为酶的激活剂。类别：类别：六、抑制剂对酶反应的影响六、抑制剂对酶反应的影响n酶的抑制作用酶的抑制作用 有些物质能与酶分子上某些必须基团结合（作用),使酶的活性中心的化学性质发生改变，导致酶活力下降或丧失。n失活作用失活作用 凡可使酶变性而引起酶活力丧失的作用。 n抑制剂抑制剂 能够引起酶的抑制作用的化合物。n抑制剂的特点抑制剂的特点 a.在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似。 b.能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体或结合物。两者的区别：两者的区别： n抑制剂对酶的抑制作用有选择性，一种抑制剂只能引抑制剂对酶的抑制作用有选择性，一种抑制剂只能引起一种酶或一类酶的活性丧失活降低，而蛋白质变性起一种酶或一类酶的活性丧失活降低，而蛋白质变性剂可使所有的酶变性失活。剂可使所有的酶变性失活。n在抑制剂与酶的结合而导致的抑制作用中，抑制剂一在抑制剂与酶的结合而导致的抑制作用中，抑制剂一般都具有以下特点：一方面在化学结构上与被抑制酶般都具有以下特点：一方面在化学结构上与被抑制酶的底物分子或底物的过渡态相似（结构上）。另一方的底物分子或底物的过渡态相似（结构上）。另一方面能够与酶的活性中心以非共价键或共价的方式形成面能够与酶的活性中心以非共价键或共价的方式形成比较稳定的复合体或结合物，而变性剂则作用方式较比较稳定的复合体或结合物，而变性剂则作用方式较多。多。抑制作用的类型抑制作用的类型 非专一性不可逆抑制非专一性不可逆抑制 不可逆抑制作用不可逆抑制作用 专一性不可逆抑制专一性不可逆抑制 抑制作用抑制作用 竞争性抑制竞争性抑制 可逆抑制作用可逆抑制作用 非竞争性抑制非竞争性抑制 反竞争性抑制反竞争性抑制 (1)不可逆抑制作用 抑制剂与酶反应中心的活性基团以共价形式结合，引起酶的永久性失活。非专一性不可逆抑制剂非专一性不可逆抑制剂 抑制剂作用于酶分子中的一类或几类基团，这些抑制剂作用于酶分子中的一类或几类基团，这些基团中包含了必需基团，因而引起酶失活。基团中包含了必需基团，因而引起酶失活。类型类型：专一性不可逆抑制剂专一性不可逆抑制剂 这类抑制剂选择性很强，它只能专一性地与这类抑制剂选择性很强，它只能专一性地与酶活性中心的某些基团不可逆结合，引起酶的活酶活性中心的某些基团不可逆结合，引起酶的活性丧失。性丧失。 实例：有机磷杀虫剂实例：有机磷杀虫剂-Ser-OH-Ser-OPO-RO-ROPO-RO-ROX（2）可逆性抑制作用抑制剂通常以非共价键与酶或酶抑制剂通常以非共价键与酶或酶- -底物复合物可底物复合物可逆性结合，使酶的活性降低或丧失；抑制剂可用透析、逆性结合，使酶的活性降低或丧失；抑制剂可用透析、超滤等方法除去。超滤等方法除去。竞争性抑制竞争性抑制非竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制反竞争性抑制 竞争性可逆抑制竞争性可逆抑制某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。活性中心结合。竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。能力来消除。动力学：动力学：VmaxVmax不变；不变；KmKm值增加，酶与底物的亲和力降低。值增加，酶与底物的亲和力降低。磺胺类药物的设计磺胺类药物的设计 竞争性抑制曲线竞争性抑制曲线 磺胺类药物的抑菌机制磺胺类药物的抑菌机制与与对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸竞竞争二氢叶酸合成酶争二氢叶酸合成酶二氢蝶呤啶二氢蝶呤啶 对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸 谷氨酸谷氨酸二氢叶酸二氢叶酸合成酶合成酶二氢叶酸二氢叶酸COOH H2N SO2NHR H2N 磺磺 胺胺 类类 药药 物物非竞争性可逆抑制非竞争性可逆抑制定义：定义： 酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与活性中心的结合，所以称为非竞争性抑制底物竞争与活性中心的结合，所以称为非竞争性抑制剂。剂。动力学：动力学：VmaxVmax减小，减小，KmKm不变，酶与底物亲和力不变。不变，酶与底物亲和力不变。金属离子，金属离子，EDTAEDTA等等 非竞争性抑制曲线非竞争性抑制曲线n定义：抑制剂不与酶结合，只与ES复合物结合，引 、 起酶活性下降。n动力学：km减少，酶对底物亲和力增加，最大反应 速度减少，也无法通过改变底物浓度而改 变反应抑制剂的影响。 n举例：多底物反应中反竞争性抑制作用反竞争性抑制作用反竞争性抑制曲线反竞争性抑制曲线（一）、酶分离纯化的一般原则与蛋白质相似 1、材料的预处理；、材料的预处理； 2、破碎细胞；、破碎细胞； 3、蛋白质的粗提（与杂质分开）；、蛋白质的粗提（与杂质分开）； 4、将蛋白质沉淀出来（等电点、盐析法、有机溶剂法）；、将蛋白质沉淀出来（等电点、盐析法、有机溶剂法）； 5、粗制品纯化（凝胶过滤法、纤维素柱色谱法、亲和层系法）。、粗制品纯化（凝胶过滤法、纤维素柱色谱法、亲和层系法）。七、酶的分离纯化和活力测定七、酶的分离纯化和活力测定1. 酶活力（酶活力（enzyme activity, 也称酶活性）也称酶活性） （二）、酶的活力与测定（二）、酶的活力与测定 酶催化一定化学反应的能力，用在一定条件下酶所催化酶催化一定化学反应的能力，用在一定条件下酶所催化反应的反应速度来表示。反应的反应速度来表示。 酶活力的大小用酶活力单位来表示，简称酶单位（酶活力的大小用酶活力单位来表示，简称酶单位（unit, U），就是表示酶量多少的单位。其表示方法与所有的测定），就是表示酶量多少的单位。其表示方法与所有的测定方法有关。方法有关。 习惯上沿用的单位如习惯上沿用的单位如 :乳酸乳酸 + NAD+ 丙酮酸丙酮酸 + NADH + H+ 乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 乳酸脱氢酶的活力可用乳酸脱氢酶的活力可用丙酮酸的增加量丙酮酸的增加量表示，也表示，也可用可用340nm光吸收的增加量光吸收的增加量来表示。来表示。 2. 酶活力单位的表示方法酶活力单位的表示方法 国际单位国际单位(IU)：1961年年 在最适条件下，每分钟催化在最适条件下，每分钟催化1mol底物的减少或产物的底物的减少或产物的生产所需的酶量为一个国际单位。生产所需的酶量为一个国际单位。 催量单位催量单位(katal)：1972年年 指在最适条件下，每秒钟使指在最适条件下，每秒钟使mol底物转化为产物所底物转化为产物所需的酶量。需的酶量。 1Kat6107IU ，可以以纳，可以以纳Kat、微、微Kat来进来进行换算。行换算。3测定酶活力时应注意几点测定酶活力时应注意几点 （1）应测反应的初速度）应测反应的初速度（2）酶的反应速度一般用单位时间）酶的反应速度一般用单位时间 内产物的增加量来表示。内产物的增加量来表示。 （3）测酶活力时应使反应温度、）测酶活力时应使反应温度、pH、离子、离子 强度和底物浓度等因素保持恒定。强度和底物浓度等因素保持恒定。 （4）测定酶反应速度时，应使）测定酶反应速度时，应使SE。 产产物物浓浓度度P(t)4. 酶活力的测定方法酶活力的测定方法 （1）分光光度法（）分光光度法（spectrophotometry） 该法要求酶的底物和产物在紫外或可见光部该法要求酶的底物和产物在紫外或可见光部分光吸收不同。分光吸收不同。 如氧化还原酶类。如氧化还原酶类。简便、迅速、准确。简便、迅速、准确。 一个样品可多次测定，有利于动力学研究。一个样品可多次测定，有利于动力学研究。 可检测到可检测到10-9mol/L水平的变化。水平的变化。 优点：优点：习惯上沿用的单位如习惯上沿用的单位如 :乳酸乳酸 + NAD+ 丙酮酸丙酮酸 + NADH + H+ 乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 乳酸脱氢酶的活力可用乳酸脱氢酶的活力可用丙酮酸的增加量丙酮酸的增加量表示，也表示，也可用可用340nm光吸收的增加量光吸收的增加量来表示。来表示。 （2）荧光法（）荧光法（fluorometry） 该法要求酶反应的底物或产物有荧光变化。该法要求酶反应的底物或产物有荧光变化。 主要的优点：灵敏度很高，可以检测主要的优点：灵敏度很高，可以检测10-12mol/L的样品。的样品。 酶蛋白分子中的酶蛋白分子中的Tyr、Trp、Phe残基以及一些辅酶、残基以及一些辅酶、辅基，如辅基，如NADH NADPH、FMN、FAD等都能发出荧光。等都能发出荧光。 例：乙醇例：乙醇 + NAD+ 乙醛乙醛 + NADH + H+ 乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶（3）酶偶联分析法）酶偶联分析法(enzyme coupling assay) 第一个酶的产物为第二个酶的底物，这两个第一个酶的产物为第二个酶的底物，这两个酶系统在一起反应。酶系统在一起反应。 2P 2E1P 1E S P1无光吸收或荧光变化，偶联后无光吸收或荧光变化，偶联后, P2有有光吸收或荧光变化。光吸收或荧光变化。例：测己糖激酶的活性例：测己糖激酶的活性 葡萄糖葡萄糖 + ATP 葡萄糖葡萄糖-6-磷酸磷酸 + ADP 己糖激酶己糖激酶葡糖葡糖-6-磷酸磷酸 + NADP 葡萄糖酸葡萄糖酸-6-磷酸磷酸 + NADPH + H+ G-6-P脱氢酶脱氢酶5. 酶的比活力（酶的比活力（specific activity，也称比活性），也称比活性） 比活力：比活力：指每指每mgmg蛋白质所具有的酶活力，一般用蛋白质所具有的酶活力，一般用U/mgU/mg蛋白蛋白 质来表示。质来表示。 比活力有时也可用每比活力有时也可用每g或每或每ml酶含多少个活力单位来表示。酶含多少个活力单位来表示。 比活力总活力单位数比活力总活力单位数蛋白质蛋白质总毫克数总毫克数 活力单位数活力单位数mg蛋白质蛋白质 (杂蛋白杂蛋白:包括酶蛋白及含非酶蛋白）包括酶蛋白及含非酶蛋白） 比活力是酶纯度衡量的重要指标之一比活力是酶纯度衡量的重要指标之一终点法（终止法）：测定完成一定量反应所需要的时间，一般 测产物的生成量比较好。动力学方法（连续法）：测定一定时间内所起的化学变化量， 灵敏度较高。6、测定酶活力的一般方法 1. 纯化倍数 2. 比活力 3. 回收率 （三）、如何衡量纯化的酶的质量（三）、如何衡量纯化的酶的质量 第第 四四 节节 酶的调节酶的调节一一 、 酶原激活的机理酶原激活的机理酶酶 原原分子构象发生改变分子构象发生改变形成或暴露出酶的活性中心形成或暴露出酶的活性中心 一个或几个特定的肽键断裂，水解一个或几个特定的肽键断裂，水解掉一个或几个短肽掉一个或几个短肽在特定条件下在特定条件下赖赖缬缬天天天天天天天天甘甘异异赖赖缬缬天天天天天天天天缬缬组组丝丝甘甘异异缬缬组组丝丝 酶原激活的生理意义酶原激活的生理意义避免细胞产生的酶对细胞进行自身消化，避免细胞产生的酶对细胞进行自身消化，并使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证并使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢正常进行。体内代谢正常进行。有的酶原可以视为酶的储存形式。在需要有的酶原可以视为酶的储存形式。在需要时，酶原适时地转变成有活性的酶，发挥其催时，酶原适时地转变成有活性的酶，发挥其催化作用。化作用。二、变构酶二、变构酶 变构酶（别构酶）变构酶（别构酶） 有些酶可以与某些化合物（称为变构剂）发生非共价结合，引起酶分子构象的改变，对酶起到激活或抑制的作用，这类酶通常称为。 结构特点结构特点 活性中心（结合部位和催化部位）和变构中心（特殊的调控部位）。 注意：注意：变构中心不是酶活性中心的组成部分。变构中心不是酶活性中心的组成部分。酶的别构（变构）效应示意图酶的别构（变构）效应示意图效应剂效应剂别别构构中中心心活性活性中心中心调节物调节物：也称效应物，一般指的是酶的底物或底物类似物：也称效应物，一般指的是酶的底物或底物类似物 或代谢的终产物。或代谢的终产物。别构效应别构效应： 调节物与别构中心结合后，诱导出或稳定住酶分子的某种调节物与别构中心结合后，诱导出或稳定住酶分子的某种构象，使酶活性中心对底物的结合和催化作用受到影响，从而构象，使酶活性中心对底物的结合和催化作用受到影响，从而调节酶的反应速度代谢过程，这种效应称为别构效应。调节酶的反应速度代谢过程，这种效应称为别构效应。 正效应物：指效应物的结合使酶活性升高，也称别构激活剂。正效应物：指效应物的结合使酶活性升高，也称别构激活剂。 负效应物负效应物: : 指效应物的结合使酶活性降低，也称别构抑制剂。指效应物的结合使酶活性降低，也称别构抑制剂。 （1 1）常为多个亚基构成的寡聚体；）常为多个亚基构成的寡聚体；（2 2）具有别构效应；）具有别构效应；（3 3）动力学曲线）动力学曲线不符合米曼方程双曲线；不符合米曼方程双曲线；（4 4）酶分子上含两个中心或部位：活性中心）酶分子上含两个中心或部位：活性中心 （活性部位）和别构中心（别构部位）。（活性部位）和别构中心（别构部位）。1963年，年，Monod等首次提出别构酶的概等首次提出别构酶的概念。他认为别构酶应具备以下特征：念。他认为别构酶应具备以下特征： 同促效应同促效应：配体相同。当一个效应物与酶结合后，配体相同。当一个效应物与酶结合后， 影响另一相同的效应物与酶的结合。影响另一相同的效应物与酶的结合。 异促效应异促效应：配体不同。当一个效应物与酶结合后，配体不同。当一个效应物与酶结合后， 影响另一不同效应物与酶另一部分结合。影响另一不同效应物与酶另一部分结合。别构效应的种类别构效应的种类1 1、根据配体性质分、根据配体性质分2、协同效应协同效应 一个效应物分子与变构酶的结合，对第二个效应一个效应物分子与变构酶的结合，对第二个效应 物分子的结合产生影响，这种效应为协同效应。物分子的结合产生影响，这种效应为协同效应。正协同效应正协同效应：指效应物分子与变构酶的结合后，本身构指效应物分子与变构酶的结合后，本身构 象发生变化，有利于后续底物分子或调节象发生变化，有利于后续底物分子或调节 物分子的结合。物分子的结合。负协同效应负协同效应：指效应物分子与变构酶的结合后，本身构指效应物分子与变构酶的结合后，本身构 象发生变化，不利于后续底物分子或调节象发生变化，不利于后续底物分子或调节 物分子的结合。物分子的结合。别构酶调节的两种模型别构酶调节的两种模型SS SS SSSSSSSSSS亚基全部亚基全部处于处于R型型亚基全部亚基全部处于处于T型型依次序变化依次序变化序变模型（序变模型（KNW）：）：1966年由年由Koshland、Nemethy和和Filmer 提出。提出。 齐变模型（齐变模型（MWCMWC）：）： 19651965年由年由MonodMonod、WymanWyman和和ChangeuxChangeux提出。提出。 S SSSS SSS SST状态（对称亚基）状态（对称亚基）T状态（对称亚基）状态（对称亚基）SSSS对称亚基对称亚基对称亚基对称亚基齐步变化齐步变化别构酶与非调节酶动力学曲线的比较别构酶举例：天冬氨酸转氨甲酰酶，简称ATCaseATCase活性调节的机理活性调节的机理 CTPATP有催化活性的构象有催化活性的构象 无催化活性的构象无催化活性的构象 CCCCCCR汞汞盐盐完完整整的的催催化化亚亚基基调调节节亚亚基基CCCCCC+（三三聚聚体体）（二二聚聚体体）（活活性性）ATCaseRR RR RR RR RR R三、三、 同工酶同工酶* * 定义定义指同一种属中由不同基因或等位基因编码的指同一种属中由不同基因或等位基因编码的多肽链组成的单体、纯聚体或杂交体，多肽链组成的单体、纯聚体或杂交体，能能催化相催化相同的化学反应，而同的化学反应，而其其分子结构分子结构、理化性质乃至免理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。疫学性质不同的一组酶。乳酸脱氢酶的同工酶乳酸脱氢酶的同工酶乳酸脱氢酶同工酶形成示意图乳酸脱氢酶同工酶形成示意图多肽多肽亚基亚基mRNA四聚体四聚体结构基因结构基因a b乳酸脱氢酶同乳酸脱氢酶同工酶电泳图谱工酶电泳图谱+H4MH3M2H2M3HM4点样线点样线问答题问答题1、影响酶促反应的因素有哪些？它们是如何影响的？、影响酶促反应的因素有哪些？它们是如何影响的？2、试比较酶的竞争性抑制作用与非竞争性抑制作用的异同。、试比较酶的竞争性抑制作用与非竞争性抑制作用的异同。3、什么是米氏方程，米氏常数、什么是米氏方程，米氏常数Km的意义是什么？试求酶反应速度达到最的意义是什么？试求酶反应速度达到最大反应速度的大反应速度的99时，所需求的底物浓度（用时，所需求的底物浓度（用Km表示）表示）4、什麽是同工酶？为什麽可以用电泳法对同工酶进行分离？同工酶在科学、什麽是同工酶？为什麽可以用电泳法对同工酶进行分离？同工酶在科学研究和实践中有何应用？研究和实践中有何应用？5、举例说明酶的结构和功能之间的相互关系。、举例说明酶的结构和功能之间的相互关系。6、称取、称取25毫克某蛋白酶制剂配成毫克某蛋白酶制剂配成25毫升溶液，取出毫升溶液，取出1毫升该酶液以酪蛋白毫升该酶液以酪蛋白为底物为底物,用用Folin-酚比色法测定酶活力酚比色法测定酶活力,得知每小时产生得知每小时产生1500微克酪氨酸。另微克酪氨酸。另取取2毫升酶液，用凯式定氮法测得蛋白氮为毫升酶液，用凯式定氮法测得蛋白氮为0.2毫克。若以每分钟产生毫克。若以每分钟产生1微克微克酪氨酸的酶量为一个活力单位计算，根据以上数据，求出（酪氨酸的酶量为一个活力单位计算，根据以上数据，求出（1）1毫升酶液毫升酶液中含有的蛋白质和酶活力单位数；（中含有的蛋白质和酶活力单位数；（2）该酶制剂的比活力；（）该酶制剂的比活力；（3）1克酶制克酶制剂的总蛋白含量和酶活力单位数。剂的总蛋白含量和酶活力单位数。名词解释名词解释活性中心活性中心 全酶全酶 酶原酶原 活力单位活力单位 比活力比活力 米氏方程米氏方程 Km 诱导契合变构效应诱导契合变构效应 ribozyme 辅酶和辅基辅酶和辅基 固定化酶固定化酶