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PCR技术的原理、操作及应用技术的原理、操作及应用湖南省疾病预防控制中心微生物检验科湖南省疾病预防控制中心微生物检验科 黄一伟黄一伟什么是什么是PCR PCR: Polymerase chain reaction，即聚合酶链反应 是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术 PCR技术的发展历史技术的发展历史1985 关于PCR 的文章首次由美国科学家Kary Mullis等人在 Science杂志上发表 1989 Science杂志报道了耐热性DNA多聚酶 Taq酶（生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到的一种耐热的DNA聚合酶 ）的发现,预示着分子时代的到来。12月Science杂志将PCR和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子”。1993 Kary Mullis 因PCR的发明获得诺贝尔化学奖。PCR技术的原理技术的原理 1遗传物质：细胞核 染色体 DNA（脱氧核糖核酸和磷酸链和碱基构成)碱基（A、T、C、G）是按双链螺旋排列的，碱基序列的长度和排列的顺序决定了生物的多样性。比如人类体细胞中共有31亿个碱基对，按上述的0.1%的差，人和人之间有3百万个碱基对的差别。 PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。PCR技术的原理技术的原理 2PCR反应的基本成分包括7种基本成分：模板DNA、特异性引物、热稳定DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸（dNTP）、二价阳离子、缓冲液及一价阳离子基本反应步骤 ：变性-退火-延伸最后通过染料如EB染色DNA后在紫外灯下显色检出PCR技术的原理技术的原理 31234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2535轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍RT-PCR的原理的原理 相对于PCR，在开始阶段增加步骤：RNA cDNA合成，是单链到双链的过程。实时荧光定量实时荧光定量PCR的原理的原理 1 实时荧光定量PCR技术 (Real-Time Quantitative PCR) 是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。常用的荧光定量PCR试剂：SYBR Green I Taqman水解探针实时荧光定量实时荧光定量PCR的原理的原理 2基线（Baseline） 是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即基线。光阈值threshold的设定 一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。CT(Cycle threshold)值 表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小，反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表CT值。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。实时荧光定量实时荧光定量PCR的原理的原理 3 Ct与初始模板的关系 固定循环数后，荧光信号与模板数成正比 初始DNA量越多, 荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct 值)越少 起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系，根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量0.000.501.001.502.002.503.001416182022242628303234363840CycleRn阈值阈值104103102PCR技术的优点技术的优点优点: 特异 敏感 快速、 简便 易自动化等PCR技术的局限性技术的局限性 为了构建特定引物，使特定DNA序列的选择性扩增，必须有一个庞大的已知序列的数据库。 聚合酶链反应效率差异很大，根据不同的因素需要优化反应条件。 PCR技术扩增产物的长度有限。 PCR技术的注意事项技术的注意事项 防止污染，建立良好的质量控制。操作时避免气溶胶产生，特别注意阳性样品的拿放，使用一次性耗材，穿戴手套并经常更换，永远在最后一步才加核酸，液体分装使用等。 引物设计合理 Taq酶扩增错误率较高，大约1/100对碱基/20个循环 镁离子浓度对反应效率的影响 仪器稳定性，升降温速率，管子的密合度等 RT-PCR注意防止RNA降解PCR技术的操作技术的操作 1 以流感病毒的RT-PCR和Real-time RT-PCR检测为例说明PCR技术的操作步骤 主要仪器：PCR仪，Real-time PCR仪，微量移液器，高速冷冻离心机，电泳仪和电泳槽，凝胶电泳观察仪或成像系统，生物安全柜等。PCR技术的操作技术的操作 2 1. 病毒核酸RNA提取 2. RT-PCR反应或者Real-time RT-PCR反应 3. UV紫外灯检测或者电脑上直接读取结果流感病毒核酸提取流感病毒核酸提取 1试验材料 QIAGEN公司的Rneasy Mini Kit (或QIAGEN公司的QIAmp Viral RNA Mini Kit，操作类似) -巯基乙醇（-mercaptoethanol） 70% 乙醇 无菌及DNA,RNA酶的1.5ml 离心管 10l、20l、200l、1000l加样器和枪头 可调13K微型冷冻离心机 待检流感病毒200l流感病毒核酸提取流感病毒核酸提取 21、取采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）200ul加在1.5ml Eppendorf管中2、依次加入350ul RLT液、3.5ul-巯基乙醇和70%的乙醇550ul混匀3、将Rneasy mini spin柱子置于干净的2ml收集管上，将2步骤的混合液600ul吸出加入柱子中，12，000rpm，离心15秒，弃收集管中的离心液4、柱子仍放回收集管上，将2步骤剩余的混合液全部吸到柱子上，12，000rpm，离心15秒，弃离心液5、于柱子中加入700ul Wash Buffer RW1液，12，000rpm，离心15秒6、取一支干净的2ml收集管，将离心后的柱子移到新的收集管上，于柱子中加入500ul Wash Buffer RPE液，12，000rpm，离心15秒 7、弃收集管中的离心液，再于柱子中加入500ul Wash Buffer RPE液，13，000-14，000rpm，离心2分钟 8、将柱子移到一干净的1.5ml的eppendrof管上，于柱子中加入20-50ul的Rnase-free Water，室温静置1-3分钟 9、12，000rpm，离心1分钟，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即做实验或-20以下保存 试剂盒为QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit （catalog #74104） 注意：试剂盒中的RPE液用前需加44ml 的无水乙醇，使终体积达到55ml。RT-PCR反应反应 1试验材料lQIAGEN One Step RT-PCR Kit （Cat No 210212）lRNase inhibitor 40u/ll上游引物 200ng/ll下游引物 200ng/l扩增H5亚型禽流感病毒的引物 序列为： H5-1: 5-GCC ATT CCA CAA CAT ACA CCC-3，H5-3: 5-CTC CCC TGC TCA TTG CTA TG-3 l提取的RNART-PCR反应反应 2 1、 分别标记好0.2ml的微量离心管。 在每个管中加入如下内容： 5 ul QIAGEN OneStep RT-PCR buffer，5 1 ul 10mM dNTPs 1 ul Enzyme Mix 0.13ul RNase inhibitor (40U/ul) 14.3ul Rnase-free water 2、 加 1ul 的引物 加 5ul 未知RNA或5 ul 阳性对照或Rnase-free water作为阴性对照。RT-PCR反应反应 3 OneStep RT-PCR反应条件如下： 50作用30分钟（逆转录：RNA cDNA） 95作用15分钟（使逆转录酶等失活） 94变性30秒 55退火30秒 72延伸30秒 回到第3步，34个循环 72作用2分钟 结束RT-PCR扩增产物检测扩增产物检测 1 凝胶电泳缓冲液配方10TBE缓冲液(每升) ：Tris107.8g Boric Acid55.0g EDTA(Na2)8.2g10TAE缓冲液(每升) ：Tris48.4g 冰乙酸 11.42g 0.5mol/L EDTA 20ml 用电泳缓冲液制备1.5%琼脂糖凝胶，按每孔8ulPCR产物上样至胶中。 100伏电泳30min，紫外观察并拍照记录。RT-PCR扩增产物检测扩增产物检测 2 RT-PCR扩增产物检测及结果判定Real-time RT-PCR的操作的操作 1 病毒核酸RNA提取：同RT-PCR Real-time RT-PCR：以匹基公司禽流感检测试剂盒为例，按试剂盒操作说明，25l反应体系：RT-PCR反应液 15l，Taq酶 0.25l，逆转录酶n/4颗（n为PCR管数），待检RNA 10l，加好RNA后400g离心5sec，将PCR管排好放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。反应条件为：42 30min；92 3min；92 10sec, 45 30sec 72 1min 5个循环；92 10sec, 60 30sec 40个循环，60时设置收集荧光。 Real-time RT-PCR的操作的操作 2 结果分析条件设定 读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准；或可根据仪器噪音情况进行调整。CT(Cycle threshold)值 表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小，反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表CT值。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。基线（Baseline） 是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即基线。光阈值threshold的设定 一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。Real-time PCR的操作的操作 3 结果判定 1、质控标准 1.1阴性对照的检测结果为阴性。 1.2阳性对照的Ct值应小于等于28.0。否则，此次实验视为无效。 2、结果判断 2.1 Ct值无数值的样本为阴性样本。 2.2 Ct值30.0的样本为阳性。 2.3Ct值大于30.0的样本建议重做。重做结果无数值者为阴性，否则为阳性。PCR技术的应用技术的应用 基因克隆、测序和表达等 法医学个体识别和亲子鉴定 遗传性疾病检测、肿瘤诊断、病原体检测等基因克隆和表达基因克隆和表达DNA指纹技术指纹技术 1 1984年英国的遗传学家Alec Jeffreys在进行肌红蛋白的DNA序列研究时，意外发现非功能DNA（不产生蛋白的DNA）上重复着一种小片段DNA，这一含15个左右碱基的DNA片段，在不同个体间重复的频率及位置有明显的不同，Jeffreys首先在自己的DNA上进行研究，验证了这一技术，如果我们有血缘关系，这些不同会大大缩小。 Jeffreys命名这一技术为DNA指纹技术（DNA finger print）。DNA指纹技术指纹技术 2 采集血样（毛发、精液、口腔粘膜细胞），分离DNA，用PCR将选定的DNA片段放大，并进行对比，统计分析，便可得出是否为作案凶手或是否有血缘关系。分子诊断学分子诊断学 分子诊断学是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据 。分子诊断学的发展阶段分子诊断学的发展阶段分子诊断学大致经历了3个阶段： （1）利用DNA分子杂交技术进行遗传病的基因诊断； （2）以PCR技术为基础的DNA诊断，特别是定量PCR和实时PCR的应用，不仅可以检测存在于宿主的多种DNA和RNA病原体载量，还可检测多基因遗传病细胞中mRNA的表达量 （3）以生物芯片（biochip）技术为代表的高通量密集型检测技术，生物芯片技术包括基因芯片，蛋白质芯片，组织芯片等 。分子诊断学的发展方向分子诊断学的发展方向分子诊断学的发展方向：（1）分子诊断的内容从传统的DNA诊断发展到核酸及其表达产物（mRNA、蛋白质）的全面诊断；（2）分子诊断的策略从利用分子杂交、PCR等单一技术的诊断发展到有机组合多项技术的联合诊断；（3）分子诊断的方法从定性诊断发展到半定量和定量诊断，核酸标记技术，特别是荧光标记技术的发展，荧光定量PCR技术等方法日益成熟；（4）分子诊断的范围从单基因疾病（门德尔遗传性疾病，诸如白血病、早老症、血红蛋白病、甲型肝炎病毒，人类免疫缺陷病毒，人乳头瘤病毒等）的诊断发展到多基因病（肿瘤、心脑血管疾病、代谢病、神经系统疾病、自身免疫性疾病等）的诊断；（5）分子诊断的应用多治疗性诊断发展到预防性分析评价，特别是针对高危人群进行疾病基因或疾病相关基因的筛查。