2021-2022年收藏的精品资料生化实验报告离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶.doc

实验报告一、实验目的和要求三、实验材料和主要仪器五、实验数据记录和处理七、实验讨论和心得二、实验内容和原理四、实验方法和步骤六、实验结果和分析一、实验目的和要求1、学习离子交换层析的基本原理 2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法二、实验内容和原理1、离子交换层析由于蔗糖酶的pI偏酸性,所以在pH7.3 缓冲液的环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂可以先与蔗糖酶样品可逆交换吸附，然后通过用盐离子强度逐渐提高的洗脱液，使蔗糖酶和其他杂蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，把不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，从而达到分离蔗糖酶的目的。2、酶活力检测蔗糖酶是一种水解酶，它能蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。（50水解） 3.5二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。（100显色）三、实验材料和主要仪器1、实验材料 蔗糖酶粗分离纯化（溶解即为样品）2、实验试剂 DEAE-Sepharose Fast Flow 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液 20mmol/L Tris-HCl（1mol/L NaCl）pH7.3缓冲液 0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5 5%蔗糖溶液 3，5-二硝基水杨酸试剂3、实验仪器（1）高速冷冻离心机（2）层析柱（1.0×20 ）(1支/组）（3）ÄKTATM start（1套/组）（4）部分收集器及收集试管（4ml/管）（1台/组）（5）20冰箱（保存样品用）（6）微量移液枪 200ul、1000ul（7）1.5ml离心管（留样品和样品用）（8）7ml离心管（留样品用）（9）恒温水浴（50、100）（10）试管、移液管、试管架等四、实验方法和步骤1、仪器连接（1）接通各仪器电源，将A,B泵头分别放置A，B两个溶液瓶中。注意B为含NaCl溶液。（2） 点击电脑桌面上Unicorn软件图标，打开软件。选择System Control ，点击OK，进入操作界面。点击Connect（3） 在操作界面的工具栏，点击Mannual Run。出现FlowRate 窗口，调节flowrate为 1ml/min，确定。2、装柱与平衡（1）检查层析柱的两端接头，底端有膜的置于下方。（2）程序暂停。将层析柱放入卡槽，上端接头与混合器（Mixer)相连，下端接头与样品阀（Sample valve)相连。（3）BufferA平衡一个柱体积（约20ml=20min）3、加样停止加入20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。待缓冲液液面与胶体表面相切时，程序暂停pause。旋开柱上方接头，用胶头滴管缓慢将5ml蔗糖酶蛋白样品溶液（样品）加入层析柱中，注意顺着柱壁滴加，尽可能保持胶面平整。程序继续continue，使样品溶液进入胶体，待样品溶液完全进入胶体后，程序暂停pause，用少量洗脱缓冲液将残余在层析柱壁上端的样品洗下，并完全进入胶体后，再加缓冲液至一定高度。4、洗脱（梯度洗脱法）（1）加样后，先用BufferA进行洗脱，洗去未被凝胶吸附的杂蛋白（20min左右）；（2）待层析柱流出液在仪器上绘出的基线稳定，在程序主界面的工具栏 Manual Execute manual instruction pumps Gradient，在两个框内均填入100，点击insert，最后点击一次execute，开始梯度洗脱。每2min接一管，当Conductivity上升至8 mS/cm 时，开始测定各管的蔗糖酶活力；（3）将蔗糖酶活力高的若干管酶液（2-3管）合并，测量总体积V4（样品），样品用7ml离心管20保存。5、蔗糖酶活力检测空白对照（1）样品管（n）0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.50.5ml0.5ml5%蔗糖溶液0.5ml0.5ml蒸馏水1.0ml0.95ml部分收集的酶液/0.05ml 50水浴5min 3.5二硝基水杨酸试剂(DNS)0.5ml0.5ml 100水浴2min 蒸馏水3.0ml3.0ml观察颜色五、实验数据记录和处理上次实验粗提取的蔗糖酶蛋白溶液V3=12.3ml本次实验加样的蔗糖酶蛋白溶液V3=5.0ml蔗糖酶活力高的两管酶液合并后V4=4.0ml六、实验结果和分析1、洗脱曲线（1） UV曲线 在55-70min时，UV曲线有两个峰值，这是未被凝胶吸附的杂蛋白的体现。 85-95min的峰值性状较为“规准”，但经过活性检测发现为杂蛋白。 105-120min有一个峰值较小的峰，经过活性检测其中含有活性较高的蔗糖酶。实验名称：_离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶_姓名： 吴逸璇 学号： 3170100207 （2） 在73min左右，BufferValve B的值瞬间上升，这是由于操作失误导致的。当时直接把Buffer valve的阀门由A转换到B，而没有一个梯度的上升。但好在及时止损，开始了正确的操作。正确操作：“在程序主界面的工具栏 Manual Execute manual instruction pumps Gradient，在两个框内均填入100，点击insert，最后点击一次execute，开始梯度洗脱。”（3）Conductivity的值随着Buffer B浓度的增长而增长（导电性增加）。2、蔗糖酶活力检测对比图如图示，从左到右，第3管和第5、6管都分别有较深的颜色（由于手机、光线等原因，图示颜色比实际颜色要浅，实际颜色更深），说明在对应的两个时间段内洗脱出活性较高的蔗糖酶。七、实验讨论和心得1、如上所述，在层析柱流出液在仪器上绘出的基线稳定后进行Buffer B的梯度洗脱时，进行了错误的操作（直接将Buffer valve的阀门由A转换到B），这导致了Buffer B浓度的突然上升，在之后一段时间内，较高浓度的Buffer B可能将柱上部分蔗糖酶与杂蛋白一起洗脱下去，导致之后的第一个峰没能够检测出目标蛋白。2、什么是梯度洗脱？梯度洗脱（gradient elution）又称为梯度淋洗或程序洗脱。在同一个分析周期中，按一定程度不断改变流动相的浓度配比，称为梯度洗脱。在同一个分析周期中，按一定程度不断改变流动相的浓度配比，称为梯度洗脱。从而可以使一个复杂样品中的性质差异较大的组分能按各自适宜的容量因子k达到良好的分离目的。梯度洗脱的优点：1.缩短分析周期；2.提高分离能力；3.峰型得到改善，很少拖尾；4.增加灵敏度。但有时引起基线漂移。3、心得这次实验使用的主体仪器是ÄKTATM start，这台仪器的存在大大改良且简化了实验操作，同时也增高了实验的成功率。听杨老师说，在没有这台仪器之前的学生们，做这个实验都会耗费更多的时间，还可能手忙脚乱。不仅感叹，科学的研究促进了技术的发展，技术的进步又反作用于科学研究，这无形中构成了一个良性循环，生生不息，源远流长。