土壤中分解尿素的细菌的分离与计数上课ppt课件.ppt

（一）筛选菌株（一）筛选菌株 提出的问题提出的问题 如何寻找如何寻找耐高温耐高温的酶？的酶？ 解决问题的思路解决问题的思路 寻找寻找耐高温耐高温环境；环境； 原理原理 高温淘汰其他菌，选出耐高温细菌，高温淘汰其他菌，选出耐高温细菌， 耐高温菌种提取耐高温酶。耐高温菌种提取耐高温酶。 启示：启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。（筛选思路）求，到相应的环境中去寻找。（筛选思路） 原因：原因：因为热泉温度因为热泉温度707080800 0C C，淘汰了绝大多数，淘汰了绝大多数微生物只有微生物只有TaqTaq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。 DNA DNA多聚酶链式反应多聚酶链式反应是是一种在体外将一种在体外将少量少量DNADNA大量大量复制复制的技术，此项技术要求的技术，此项技术要求使用使用耐高温（耐高温（72720 0C C）的）的DNADNA聚合酶。聚合酶。从哪里去寻找这种耐高温的酶呢？为什么？从哪里去寻找这种耐高温的酶呢？为什么？ . .分析该配方的培养基对微生物是否具有筛选分析该配方的培养基对微生物是否具有筛选作用？如果有，又是如何进行筛选的？作用？如果有，又是如何进行筛选的？ 有筛选作用。有筛选作用。尿素是培养基中的尿素是培养基中的唯一氮源唯一氮源，因此，原则上只有，因此，原则上只有能够利用能够利用尿素尿素的微生物才能够生长。的微生物才能够生长。答：不一定，答：不一定，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能够在选择培养基上生长的微生长繁殖，因此能够在选择培养基上生长的微生物不一定是所需要的微生物，还需要进一步的物不一定是所需要的微生物，还需要进一步的验证。验证。 .只要能够在选择培养基上生长的微生物是否就只要能够在选择培养基上生长的微生物是否就是所需要的微生物？是所需要的微生物？以尿素为以尿素为唯一氮源唯一氮源的培养基的培养基牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨培养基培养基 是是分离分离能分能分解尿解尿素的素的细菌细菌判断该判断该培养基培养基有无选有无选择性择性实验组实验组对照组对照组培养基类型培养基类型是否是否接种接种 目的目的 结果结果生长能分生长能分解尿素的解尿素的细菌细菌生长多种生长多种微生物微生物是是对位训练对位训练分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是（ ） 加尿素加尿素 不加尿素不加尿素 加琼脂加琼脂 不加琼脂不加琼脂 加葡萄糖加葡萄糖 不加葡萄糖不加葡萄糖 加硝酸盐加硝酸盐 不不 加硝酸盐加硝酸盐 A.A.B.B. C. C.D.D.C 当样品的当样品的稀释度足够高稀释度足够高时，培养基表时，培养基表 面生长的面生长的一个菌落一个菌落，来源于样品稀释，来源于样品稀释 液中的液中的一个活菌一个活菌，通过统计平板上的，通过统计平板上的 菌落数，就能推测出样品中大约含有菌落数，就能推测出样品中大约含有 多少活菌。多少活菌。 例：两位同学用稀释涂布平板法测定同例：两位同学用稀释涂布平板法测定同 一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为10106 6的培养基中，得到以下两种统计结果。的培养基中，得到以下两种统计结果。 1 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为菌落数为230230。 2 2、乙同学在该浓度下涂布了、乙同学在该浓度下涂布了A A、B B、C C三个平板，三个平板，统计的菌落数分别为统计的菌落数分别为2121、212212、256256，该同学以这三，该同学以这三个平板上菌落数的平均值个平板上菌落数的平均值163163作为统计结果。作为统计结果。 你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？错在哪？ 甲：没有甲：没有重复实验重复实验（至少涂布（至少涂布3 3个平板）个平板） 乙：乙：A A组结果误差过大，不应用于计算平均值组结果误差过大，不应用于计算平均值实验组：实验组：对照组对照组：2.判断选择培养基是否具有选判断选择培养基是否具有选择择作用作用1.判断培养基是否被杂菌污染判断培养基是否被杂菌污染实验组：实验组：对照组对照组：接种的培养基接种的培养基未接种的未接种的培养基培养基（空白对照）（空白对照）在相同条件下培养，观察未接种的培养基上是否有菌落。在相同条件下培养，观察未接种的培养基上是否有菌落。选择培养基选择培养基牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基接种后培养，观察两种培养基上菌落数目，进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目，进行对比得出结论。对比得出结论。二 实验设计二 实验设计1. 实验设计的内容包括：二 实验设计1. 实验设计的内容包括：实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等。实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等。 在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为培养基可以作为对照对照，用来判断选择培养基是否，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。起到了选择作用。制备培养基：制备培养基：准备准备牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基和和选择培养基。选择培养基。 二 实验设计1. 实验设计的内容包括：2. 实验流程：实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等。实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等。二 实验设计1. 实验设计的内容包括：2. 实验流程：实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等。实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等。（1）土壤取样）土壤取样二 实验设计1. 实验设计的内容包括：2. 实验流程：（1）土壤取样）土壤取样从从肥沃、湿润肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土的土壤中取样。先铲去表层土3 cm左右，再取样，将样品装入事先准备左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。好的信封中。实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等。实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等。土壤细菌绝大多数分布在距地土壤细菌绝大多数分布在距地表约表约38cm的土壤层的土壤层二 实验设计（2）样品的稀释）样品的稀释二 实验设计（2）样品的稀释）样品的稀释样品的稀释程度将直接影响平样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。板上生长的菌落数目。 （1 1）测细菌数：一般用）测细菌数：一般用10104 4、10105 5、10106 6稀释液稀释液 （2 2）测放线菌：一般用）测放线菌：一般用10103 3、10104 4、10105 5稀释液稀释液 （3 3）测真菌数：一般用）测真菌数：一般用10102 2、10103 3、10104 4稀释液稀释液 原则：确保平板上的菌落数在原则：确保平板上的菌落数在3030 300300之间。之间。将待测样品经过一系列的稀释，然后选择将待测样品经过一系列的稀释，然后选择三个三个稀释度稀释度的菌液均匀涂布在平板上，然后培养。的菌液均匀涂布在平板上，然后培养。 将将10 g10 g土样加入盛有土样加入盛有90 mL90 mL无菌生理盐水无菌生理盐水的锥形瓶中，充分摇匀，吸取上清液的锥形瓶中，充分摇匀，吸取上清液1 mL1 mL，转，转移至盛有移至盛有9 mL9 mL的生理盐水的无菌大试管中，依的生理盐水的无菌大试管中，依次等比稀释至次等比稀释至10107 7稀释度，并按照由稀释度，并按照由10107 710103 3稀稀释度的顺序分别吸取释度的顺序分别吸取0.1 mL0.1 mL进行进行平板涂布操作平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换不必更换移液管移液管。 由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为10103 310107 7。为了结果接近真实值，可将同一稀释度菌液涂为了结果接近真实值，可将同一稀释度菌液涂布到布到3个或个或3个以上的平板上，经培养，计算出个以上的平板上，经培养，计算出菌落的平均数。菌落的平均数。 为什么分离不同的微生物要采用不同的稀为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？吗？ 答：这是因为土壤中各类微生物的数量是不同答：这是因为土壤中各类微生物的数量是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性好氧及兼性厌氧细菌厌氧细菌数约为数约为2 1852 185万，万，放线菌数放线菌数约为约为477477万，万，霉菌数霉菌数约为约为23.123.1万。万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。培养的条件。实验时要实验时要对培养皿作对培养皿作好标记。注好标记。注明培养基类明培养基类型、培养时型、培养时间、稀释度、间、稀释度、培养物等。培养物等。将涂布好的培养皿放在将涂布好的培养皿放在30 30 温度下培养。温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。 比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。量、形态等，并做好记录。 （4 4）微生物的培养与观察微生物的培养与观察 （5 5）鉴定：筛选后必鉴定）鉴定：筛选后必鉴定鉴别培养基：不影响微生物的生存鉴别培养基：不影响微生物的生存挑选选择培养基中不同形态的菌落接入挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含含酚红酚红培养基的斜面中，观察能否产生如培养基的斜面中，观察能否产生如课本中图课本中图2-102-10的颜色反应。如果有则说明的颜色反应。如果有则说明该该选择培养基中选择培养基中确实含有确实含有能分解尿素的细能分解尿素的细菌。菌。酚红培养基：酚红培养基： 鉴定分解尿素的细菌鉴定分解尿素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分解成氨原理：脲酶催化尿素分解成氨培培养基碱性增强养基碱性增强 酚红变红酚红变红脲酶阳性脲酶阳性酚红在低酚红在低pH值时呈现黄色值时呈现黄色,在高在高pH值时呈现红色值时呈现红色（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落选出菌落 对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。（二）（二）获得某一稀释度下，菌落数获得某一稀释度下，菌落数3030300300的平板，在这的平板，在这以稀释度下是否至少有两个平板的菌落数相接近？以稀释度下是否至少有两个平板的菌落数相接近？ 如果得到了如果得到了2个或个或2个以上菌落数目在个以上菌落数目在30300的平板，的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。（三）（三） 如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该接如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，教师需要引导学生一起分析近。如果结果相差太远，教师需要引导学生一起分析产生差异的原因。产生差异的原因。菌种的进一步鉴定菌种的进一步鉴定 （1 1）原因：由于分离分解尿素的细菌的选择培养基上可能生长着）原因：由于分离分解尿素的细菌的选择培养基上可能生长着以分解尿素的细菌的代射产物为氮源的其它微生物。以分解尿素的细菌的代射产物为氮源的其它微生物。（2 2）原理：）原理：CO( (NH2 2) )2 2+ +H2 2O CO2 2+2+2NH3 3；由于；由于NH3 3的产生，的产生，培养基碱性增强，培养基碱性增强，pH升高，因此可通过检测升高，因此可通过检测pH的变化来判断该的变化来判断该化学反应是否发生。化学反应是否发生。（3 3）方法：以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养）方法：以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌，若指示剂变红，则某种细菌，若指示剂变红，则pH升高，说明该种细菌能分解尿升高，说明该种细菌能分解尿素。素。脲酶巩固练习1.1.使用选择培养基的目的是（使用选择培养基的目的是（ ） A.A.培养细菌培养细菌 B.B.培养真菌培养真菌 C.C.使需要的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁殖 D.D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别2.2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是别是( )( ) A.CO A.CO2 2和和N N2 2 B. B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素C CD D3.3.下列说法不正确的是（下列说法不正确的是（ ）A.A.科学家从科学家从70708080度热泉中分离到耐高温的度热泉中分离到耐高温的TaqDNATaqDNA聚聚 合酶。合酶。B.B.统计某一稀释度的统计某一稀释度的5 5个平板的菌落数依次为个平板的菌落数依次为M1M1、M2M2、 M3M3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作为该样品菌落数的估计值。作为该样品菌落数的估计值。C.C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。种类最多。4.4.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）加入（） A.A.较多的氮源物质较多的氮源物质 B.B.较多的碳源物质较多的碳源物质 C.C.青霉素类药物青霉素类药物 D.D.高浓度食盐高浓度食盐B BC C