猪肉中卡拉胶的检测（征求意见稿） .doc

ICS 67.120.10X 09NY中华人民共和国 农业 行业标准NY/T XXXXX201X猪肉中卡拉胶的检测Determination of carrageenan in pork（征求意见稿）201X - XX - XX 发布201X - XX - XX 实施中华人民共和国农业农村部 发 布附件 4NY/T XXXXX201X目 次前言.II1 范围.12 规范性引用文件.13 原理.14 试剂或材料.15 仪器设备.26 试样处理与保存.27 试样溶液制备.28 测定.39 结果计算.410 方法精密度.511 方法定量限和回收率.5附录 A 参考质谱条件（资料性附录） .6附录 B 多反应监测色谱图（资料性附录） .7附录 C 样品的添加浓度及回收率数据（资料性附录） .9附录 D 实验室内重复性要求（规范性附录） .10附录 E 实验室间再现性要求（规范性附录） .11NY/T XXXXX201X前 言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。 本标准由全国屠宰加工标准化技术委员会（SAC/TC 516）归口。 本标准起草单位： 本标准主要起草人：NY/T XXXXX201X猪肉中卡拉胶的检测1 范围本标准规定了猪肉中掺假成份卡拉胶定性及定量检测的液相色谱串联质谱方法,适用于猪肉中掺 假成份卡拉胶的定性及定量测定。 本标准对卡拉胶的检出限为0.015g/kg，定量限为 0.05g/kg。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 GB/T 9695.19 肉与肉制品 取样方法3 原理试样经盐酸溶液处理后，其中的卡拉胶被降解生成特征性寡糖。用液相色谱-串联质谱仪检测寡糖 含量，外标法定量。4 试剂或材料除另有说明，所有试剂均为分析纯和符合GB/T 6682 规定的一级水。 4.1 乙腈：色谱纯。 4.2 乙酸铵：色谱纯。 4.3 浓盐酸：优级纯。 4.4 乙酸锌。 4.5 亚铁氰化钾。 4.6 卡拉胶对照品：I 型，级别：BR。4.7 0.22m 滤膜：Nylon（有机相），水系。 4.8 0.005mol/L 乙酸铵水溶液：称取乙酸铵（4.2）0.385g，用水溶解并定容至 1000mL，过 0.22m 滤膜。 4.9 0.36mol/L 亚铁氰化钾溶液：称取亚铁氰化钾（4.5）152.071g，用水溶解并定容至 1000mL。 4.10 1.04mol/L 乙酸锌溶液：称取乙酸锌（4.4）190.819g，用水溶解并定容至 1000mL。 4.11 标准储备液（10000mg/L）：称取卡拉胶 0.1000g，60恒温水浴溶解。冷却至室温后，转移至 10mL 容量瓶中并定容至刻度，即为 10000mg/L 储备液。于 4避光保存，有效期 6 个月。5 仪器设备NY/T XXXXX201X5.1 液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子（ESI）源。 5.2 分析天平：精确到 0.00001g。 5.3 天平：精确到 0.01g。 5.4 离心机：转速4 000r/min。 5.5 涡旋混合器。 5.6 组织捣碎机。 5.7 匀浆机。 5.8 恒温振荡水浴锅。6 试样处理与保存依据 GB/T 9695.19规定的方法取样。优先采集后腿肌肉。样品剔除脂肪组织，瘦肉部分 （100g）用组织捣碎机（5.6）粉碎混匀。 混匀好的样品平行分成两份，分别作为试样（50g）和留样（50g），装入洁净容器中，密封 并标记，于-1820保存。7 试样溶液制备称取5g（精确至0.01g）样品于50mL刻度离心管中。准确加入20mL水，10000r/min匀浆1min。准确 加入2mL盐酸（4.3），涡旋30s，置于80恒温水浴振荡2小时，取出后冷却至室温。依次准确加入 1.5mL 1.04mol/L的乙酸锌溶液（4.9）， 1.5mL 0.36mol/L的亚铁氰化钾溶液（4.8），涡旋1min沉淀 蛋白质。然后，于4000r/min离心5min，取上清液900µL，加入900µL乙腈稀释，过0.22m Nylon滤膜， 待上机分析。8 测定8.1 液相色谱参考条件 8.1.1 色谱柱：BEH Amide 柱（1.7m，2.1mm ×100mm）或性能相当者。 8.1.2 进样量：1µL。 8.1.3 柱温：30。 8.1.4 流速：0.4mL/min。 8.1.5 流动相：A 相：0.005mol/L 乙酸铵水溶液（4.7）；B 相：乙腈（4.1）。梯度洗脱程序见表 1。表 1 梯度洗脱程序时间时间/minA 相相/%B 相相/%0.0050502.0050502.0125754.002575NY/T XXXXX201X4.0150506.0050508.2 质谱参考条件8.2.1 离子源：电喷雾电离源（ESI）。 8.2.2 扫描方式：负离子扫描模式。 8.2.3 其它参考质谱条件见附录 A。8.3 标准曲线的制作取 5个50mL刻度离心管，分别加入标准储备液（4.11）25L、50L、100L、250L、500L。然 后加入水使液体的总体积为23.0mL。再加入2mL盐酸（4.3），加盖后在涡旋混合器（5.5）涡旋30s， 置于80 恒温水浴振荡2小时。取出后冷却至室温，4000r/min 离心5min。取上清液900µL，加入900µL乙腈（4.1）稀释，过0.22m Nylon 滤膜，分别注入液相色谱-串联质谱仪中，即为 5mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L工作液。以卡拉胶标准工作液浓度为横坐标，定量离子的 峰面积为纵坐标绘制标准曲线。典型的卡拉胶的标准溶液多反应监测图谱见附录B。8.4 定性测定8.4.1 保留时间被测试样品中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较，相对误差应在 ±2.5% 之间。8.4.2 定量离子、定性离子及离子丰度比在相同条件下进行样品测定时，如果检出的色谱峰的保留时间与标准品相一致，并且在扣除背景 后的样品质谱图中，目标化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包含一个母离子和一个子离子，而 且同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相 比，其相对偏差不超过表2规定的范围，则可判断样品中存在卡拉胶。表 2 定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度/%502050（含）1020（含）10允许相对偏差/%±20±25±30±508.5 定量测定本方法采用外标法定量测定。将试样溶液（7.1）注入液相色谱-串联质谱仪中，保留时间和定性 离子定性。根据标准曲线计算可得到试样溶液（7.1）中卡拉胶的浓度。试样溶液中卡拉胶的浓度应在 标准曲线浓度范围内。超过标准曲线最高点时应稀释后再进行分析。8.6 空白试验除不加试样外，其它操作与试样同步分析（7.1）。9 结果计算NY/T XXXXX201X结果按下式计算：1000mVcX其中：X - 样品中卡拉胶的含量，单位为g/kg；c - 由标准曲线计算出的试样溶液中卡拉胶的浓度，单位为mg/L；V - 试样溶液定容体积，单位为mL；m - 样品称样量×分取比例，单位为g。1000 单位换算系数 注：计算结果须扣除空白值。测定结果用平行测定的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。10 方法精密度10.1 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值与其算术平均值的比值（百分率），应符 合附录 D 的要求。 10.2 在再现性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值与其算术平均值的比值（百分率），应符 合附录 E 的要求。11 方法定量限和回收率11.1 定量限本方法卡拉胶的检出限为0.015g/kg，定量限为0.05g/kg。11.2 回收率当添加水平为0.05g/kg、0.1g/kg、0.25g/kg时，猪肉中卡拉胶回收率数据见附录C。NY/T XXXXX201X附 录 A (资料性附录) 参考质谱条件1 1)A.1 参考质谱条件a)检测方式：多反应监测（MRM）； b)扫描模式：负离子扫描 c)毛细管电压：-2500V（ESI-）； d)干燥气温度：325； e)干燥气流量：8L/min； f)雾化气压力：40psi； g)鞘气温度：350； h)鞘气流量：10L/min； i)多反应监测条件见表 A.1表 A.1 卡拉胶降解产物的定性离子对、定量离子、碎裂电压和碰撞能量序号序号母离子母离子(m/z)子离子子离子(m/z)碎裂电压碎裂电压(V)碰撞能量碰撞能量(eV)140324197*1901903446248324120376763446注：标*的为定量离子；以上两对MRM中以483为母离子的离子对响应较差。本方法给出的定量限、灵敏度等指标是基于以403为母离子的离子对数据。1)非商业性声明：附录 A 所列参考质谱条件仅供参考，当采用不同质谱仪器时，仪器参数可能存在差异，使用 前应调节雾化气压力、鞘气温度、干燥气温度和流量、鞘气流量、毛细管电压等参数，使质谱灵敏度达到检 测要求。 NY/T XXXXX201X附 录 B （资料性附录） 多反应监测色谱图图 A.1 5 mg/L I-卡拉胶 MRM 色谱图图 B.1 5mg/L 卡拉胶 MRM 色谱图403/97403/241403/241NY/T XXXXX201X图 B.2 样品空白 MRM 色谱图图 B.3 样品添加浓度为 0.05 g/kg MRM 色谱图403/97403/241403/241403/97NY/T XXXXX201X附 录 C (资料性附录) 样品的添加浓度及回收率数据表 C.1 样品的添加浓度及回收率的实验数据基质基质添加水平（添加水平（g/kg）回收率（回收率（%）0.0580.495.20.185.3110.2猪肉0.2590.5113.6NY/T XXXXX201X附 录 D （规范性附录） 实验室内重复性要求表 D.1 实验室内重复性要求被测组分含量（被测组分含量（mg/kg）精密度（精密度（%）0.001360.0010.01320.010.1220.1118114NY/T XXXXX201X附 录 E （规范性附录） 实验室间再现性要求表 E.1 实验室间再现性要求被测组分含量（被测组分含量（mg/kg）精密度（精密度（%）0.001540.0010.01460.010.1340.1125119_