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反刍动物体内氨与尿素代谢研究进展反刍动物体内氨与尿素代谢研究进展日期：2010-05-27 14:19编辑： 超级管理员来源：查看： 75 次核心提示：对于反刍动物，除氨基酸(Amino acid，AA)、肽和微生物蛋白质(Microbia crude protein，MCP)之外，氨与尿素在氮素整体营养、 消化与代谢过程中亦有十分重要的作用。 氨是蛋白质在瘤胃降解的主要终产物，而瘤胃微生物能利用氨合成MCP，故非蛋白氮(Nonproteinnitrogen， NPN)可作为反刍动物氮源补充料。 反刍动物能以氨盐或尿素作为其日粮中惟一氮源来满足机体对氮素的维持需要，表明瘤胃微生物具有利用NPN 合成所有必需 AA 的能力。另外，瘤胃微生物可水解尿素， 生成可利用氨，故代谢过程中产生的部分尿素从血液中再循环至瘤胃， 可缓解瘤胃内氮素的缺乏， 这使得反刍动物每天要对机体内的尿素进行大量转移或动员。因此，调控氨和再循环尿素的利用已成为提高日粮氮素利用效率的重要途径， 而反刍动物体内氨的产生、吸收与尿素循环，也就成为近年来反刍动物营养研究领域的热点。反刍动物体内氨与尿素代谢概述较单胃动物而言，反刍动物对日粮蛋白质的利用效率较低，其主要原因是瘤胃微生物将部分日粮蛋白质转化为氨。 日粮蛋白质常可分为瘤胃可降解蛋白质 （Rumen degradable protein，RDP）与瘤胃不可降解蛋白质（Rumen undegradable protein，RUP）。RDP 可转化为 MCP，进入小肠后与 RUP 一起为反刍动物生长或泌乳提供所必需的AA。 RDP 主要包括 3 个部分， 即肽、AA 和氨，而肽和 AA 可脱氨基转化为氨，故瘤胃中氨浓度常超过微生物生长的需要量。因此，瘤胃内过量的氮素常以氨的形式被吸收，进入血液，再经肝脏代谢成尿素。 在肝脏中合成的尿素，部分被扩散进入瘤胃和肠道， 部分经唾液分泌进入瘤胃， 被瘤胃或肠道微生物再利用；另一部分则经肾脏随尿排出。反刍动物体内氨的来源与去路当日粮蛋白质供应充足时，反刍动物瘤胃内的氨主要来源于日粮蛋白质的可降解部分，日粮蛋白质的过瘤胃部分和不可消化部分对瘤胃产氨的影响极小。 日粮中的 NPN （主要包括肽、游离 AA、 氨及氨化物、 核酸和胺） 在瘤胃内能被完全降解成氨， 且降解速度很快(3/小时)。瘤胃内的肽、AA 和氨等在为微生物合成蛋白质提供氮源的同时，也在肽酶和脱氨酶的作用下产氨。内源性的非尿素氮（如脱落的黏膜细胞、 唾液蛋白）和进入瘤胃的内源尿素极易产氨，其量可达 4.4 克/天，故内源因子产氨成为瘤胃产氨的重要途径之一。另外，原虫是氨的净生产者，而空气中的N2 随饲料进入瘤胃后可被特殊的瘤胃微生物固定并生成氨，但这两种途径生成的氨量很少，故在研究中常被忽略。瘤胃内氨的去路主要为合成MCP、被瘤胃壁吸收及随瘤胃食糜外流。Russell 和 Rvchlik 研究认为，90%的瘤胃细菌可利用氨作为其生长的主要氮源。 瘤胃内氨的吸收与其浓度密切相关。 氨以去离子化状态沿浓度梯度被动扩散至血液中，而氨离子不能被瘤胃壁吸收。 其原因可能是游离氨不带电且脂溶性好， 易通过生物膜，而氨离子带电且难溶于脂， 不易扩散入细胞膜。瘤胃内氨外流入十二指肠的量取决于瘤胃液中氨的浓度及瘤胃液的外流速率。 已知奶牛和绵羊十二指肠的氨流量可分别达到总进食氮的 2%和 9%。反刍动物大肠（结肠和盲肠）内同样存在微生物的消化代谢，其发酵终产物与瘤胃相似，也包括挥发性脂肪酸（Volatile fatty acids，VFA）、氨和 MCP 等。大肠内氨主要来源于瘤胃氨的流入、AA 的脱氨和内源尿素的水解等，其中以内源尿素水解产氨为主。大肠内氨的去路主要是合成 MCP、被大肠壁吸收进入血液和经粪排出。 Younes 等研究发现，给老鼠饲喂可发酵碳水化合物（Carbohydrate，CHO）含量高的日粮时，盲肠对氨的吸收显著增加，其原因可能是进入盲肠的内源尿素增加且被盲肠微生物分解， 也可能是盲肠中 VFA 浓度的增加影响了盲肠壁吸收氨的速率。 盲肠微生物生长所需的氮源主要来源于日粮中未被消化的氮、瘤胃微生物氮、未被消化的内源氮、血浆尿素氮及盲肠微生物不断自溶产生的氮等。 盲肠内氨的流量约为 4.8 克/天，其中大部分（约3.0 克/天）并未合成尿素，也未全部经粪排出，说明部分被吸收的氨在大肠内用于合成代谢。 Fondren 等认为，肽、AA 和氨是瘤胃细菌维持和生长所需的氮源，其中氨氮为瘤胃细菌优先利用，有18%?100%的微生物氮来源于氨。细菌氮中氨氮比例与其占可利用氮的比例呈正相关。 王文娟等报道，当氨为惟一氮源时，氨给瘤胃微生物提供 100%的氮，而当肽和 AA 浓度高时，氨给瘤胃微生物仅提供26%的氮。反刍动物体内的尿素循环1、尿素循环的过程反刍动物胃肠道内氨的产生、吸收与尿素循环密切相关。经瘤胃上皮和肠道黏膜吸收的氨汇入门静脉，再进入肝脏，同时体组织产生的氨也进入肝脏。 肝脏在反刍动物的氮代谢过程中作用非常关键。氨在肝脏中脱毒后转化成尿素，尿素又可再循环进入胃肠道被利用。因此， 尿素循环的过程主要包括： 氨在门静脉回流内脏组织 （Portal-drained viscera， PDV）中的吸收、尿素的合成、尿素的转移及尿素在胃肠道的水解等4 部分。氨在PDV中的吸收 近年来， 许多新技术用于研究消化道不同部位对氨在PDV中吸收的贡献，其关键是测定氨在门静脉的吸收率，以评估氨进入血液的流量。 Siddons 等提出了消化道不同部位氨氮转移的动态模型， 并发现绵羊在采食青贮料时， 小肠吸收的氨为总吸收量的25%，而采食青干草时为 37%。应用门静脉插管技术，可测定胃肠道不同部位氨吸收量占总吸收量的比例。Seal 和 Reynolds 研究了门静脉氨流量与日粮氮进食量的关系，发现门静脉氨流量占日粮氮进食量的 65%，超过了门静脉仅-氨基氮的净吸收量。Parker 等认为，门静脉氨流量的 25%?41%来源于小肠黏膜对氨的吸收。 Gross 等给绵羊真胃灌注蛋白质， 其门静脉氨流量为 20 微摩/ （min?kg 体重 0.75） ， 而饲喂苜蓿日粮时为30 微摩/ （min?kg 体重 0.75） 。另外， 在应用血管插管技术测定胃肠道不同部位氨流量的同时， 结合肝脏中尿素的合成速率，可估测组织中氨的产量。尿素的合成 氨在肝脏外的组织中具有剧毒。体内氨的循环浓度超过0.7 毫摩/升，就可引起大脑代谢紊乱， 甚至导致痉挛、 死亡。 在肝脏中， 以精氨酸等为载体， 氨和 CO2 借助 ATP，通过 4 个反应可转化为尿素，而合成的尿素中有50%的氮由氨提供，其余的氮源由天冬氨酸提供。 哺乳动物肝脏的重要功能之一是， 解除胃肠道和上皮细胞经发酵和代谢产生氨的毒性。在正常生理和营养条件下， 门静脉吸收的氨在肝脏中能有效地转化为尿素和谷氨酰胺等而解毒。日粮不同，门静脉氨浓度的变化幅度很大。门静脉中70%?95%的氨能被肝脏转化，而肝脏转移的氨较门静脉吸收的氨高4%，如此使动脉中血氨浓度保持不变。尿素的转移 反刍动物对日粮诱发的氨中毒非常敏感， 尤其是当日粮中 NPN 在瘤胃快速降解成氨并被吸收入门静脉时。Haussinger 等指出，老鼠肝脏实质细胞具有碳氮代谢的功能特异性，以确保在外周肝细胞中未被转化成尿素的氨在静脉附近的肝细胞中转化成谷氨酰胺，而谷氨酰胺中的氨基随后在肝脏中代谢转化成尿素，这一连续的反应同时也可防止细胞外pH 值下降。反刍动物谷氨酰胺净吸收量与谷氨酸的产量符合肝细胞间循环假说。Maltby 等认为， 反刍动物日粮中添加尿素时， 肝脏中氨的吸收增加， 谷氨酰胺的吸收不变或略有增加，而谷氨酸在肝脏中的净产量减少。 然而在正常饲养条件下， 氨转化成谷氨酰胺或谷氨酸不是主要的氨脱毒途径。 Lobley 等利用血管插管技术研究发现， 绵羊门静脉氨浓度上升至0.5 毫摩/升时，门静脉 NH4Cl 中有 93.5%的氮转化为 15N-尿素，6%的氮转化为谷氨酰胺。肝脏转移氨的阀值上限为 l.2?1.5 微摩/(min?g)。氨氮在肝脏中转化成尿素氮的潜在变化范围为27%?110%，产生这种差异的机制目前还不清楚。 Nolan 和 Leng 报道，绵羊肝脏中尿素合成速率为 18.4 克/天，其中2 克/天来自瘤胃上皮吸收的氨，16.4 克/天来自 AA 脱氨和肠道黏膜吸收的氨，而血液中的尿素主要通过唾液分泌途径进入瘤胃。尿素在胃肠道的水解 反刍动物以氨的形式吸收日粮中大量的氮， 这些氨氮在肝脏中几乎全部合成尿素。内源合成尿素通过体组织分泌而排泄， 或在胃肠道内循环。 相当数量的再循环尿素氮可被胃肠道中的细菌利用以满足其代谢需要，再以AA、核酸和氨的形式被重吸收，并被机体再次利用，Fondren 等认为，尿素氮以 4 种方式参与机体代谢、形成AA 并沉积在机体组织中：肝脏中非必需AA 的氨基化，如谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸；非必需 AA 借助碳架的转氨基作用，如丙氨酸和天冬氨酸；必需AA 借助碳架的转氨基作用；通过细菌合成必需 AA 与非必需 AA。内源尿素可通过瘤胃壁扩散或唾液分泌进入瘤胃， 而肝脏中合成的尿素可扩散选入小肠和大肠。 进入瘤胃的尿素氮可通过测定唾液的分泌速率和血浆尿素浓度来定量。No1an 和 Leng 报道，饲喂苜蓿的绵羊每天约有5.1 克尿素氮在胃肠道中被降解，但其中仅有 1.2 克转化为瘤胃氨，其余的在肠道中被降解。Nolan 等进一步研究发现，绵羊每天约有 5.3 克血液尿素氮进入胃肠道，其中20%在瘤胃被降解，25%在盲肠被降解。Makkar 报道，肝脏中合成的尿素有81%进入胃肠道，被降解成氨和CO2。内源尿素在瘤胃中降解的量仅占胃肠道总量的7%?13%，且瘤胃中尿素的转移速率与肝脏中的合成速率无关。给绵羊饲喂低蛋白日粮时， 肠道是尿素降解的主要部位， 而肠道中尿素的转移速率与肝脏中的合成速率呈线性相关。Koenig 等和 Newbold 等给绵羊分别饲喂牧草与精料、颗粒青干草时,其瘤胃氨流量的 20%来自尿素氮。Kennedy 和 Milli gan 报道，通过瘤胃上皮细胞转运的尿素占总转运量的 90%。尿素从血液向胃肠道的转移实质上是其降解成可被微生物利用、重吸收或可被机体再利用氨氮的过程。2、影响尿素循环的因素瘤胃中的氨浓度和 VFA 尿素转运至瘤胃的量与瘤胃中氨浓度呈负相关， 即氨浓度是尿素转移至瘤胃的重要调节因子。 同位素示踪技术的研究结果表明， 在牛和绵羊的真胃与瘤胃灌注外源尿素，若提高瘤胃氨的连续灌注浓度，则转移至瘤胃的尿素量显著减少。Remond 等认为，瘤胃中氨的吸收不仅受瘤胃液中氨浓度的影响， 也受 VFA 吸收速率的影响。瘤胃尿素循环存在差异主要是由瘤胃中氨浓度与CO2 压力所致， 通过瘤胃壁的氨净流量及游离氨与总氨浓度呈线性相关。VFA（乙酸、丙酸、丁酸及其混合物）可促进瘤胃上皮对氨的吸收，丁酸也可提高氨转移至绵羊瘤胃壁静脉的速率。瘤胃中有机物的消化 同位素示踪技术的研究结果表明，在反刍动物日粮中补充能量饲料（如谷物、淀粉等），可显著提高胃肠道中内源尿素的降解。 Kennedy 报道，日粮中添加蔗糖可显著增加转运至瘤胃的尿素量，当肉牛饲喂干草和蔗糖时，尿素氮转运至瘤胃的量为2l.8 克/天，而不加蔗糖时为 10.9 克/天。Huntington 指出，瘤胃中日粮能量浓度或发酵力对内源尿素转运速率和部位的影响非常明显。血浆中的尿素浓度 尿素由血液向胃肠道的转移受血浆中尿素浓度的影响。 绵羊血浆尿素浓度阀值上限为 6.0 毫摩/升，牛为 4.0 毫摩/升，超过这一上限，尿素转运不再与血浆尿素浓度呈线性相关， 也不增加瘤胃中氨浓度， 说明瘤胃氨浓度对尿素进入瘤胃的过程有抑制调节（反馈调节）作用。Makkar 和 Kennedy 报道，血浆尿素浓度与回肠和结肠中氨浓度密切相关，且回肠和结肠中尿素的转移与血浆中尿素浓度及其产生速率密切相关。饲养水平 Kennedy 和 Milligan 研究表明，血浆尿素浓度几乎不受日粮因素的影响，当尿素氮进食量从 18.5 克/天降到 11.4/天时，瘤胃上皮对尿素的降解从13.9 克/天下降到 6.1克/天。 Chapa 等报道， 血浆尿素氮用于合成细菌蛋白的量与犊牛采食的蛋白水平呈负相关。Sarraseca 等报道，绵羊尿素氮的产量和进入胃肠道的尿素氮随采食量的增加而增加，但进入鸟氨酸循环的比例不随采食量的变化而变化。 Lapierre 等研究发现， PDV 中氨的释放量随采食量的增加而增加，而尿素的转移量不受采食量的影响。其他因素 瘤胃液中氢浓度与纤毛虫的数量呈正相关， 去原虫反刍动物瘤胃液中氨浓度较低，且氨的吸收液较低。不同动物品种对氨的产生、吸收与尿素循环也有影响。Thomas 等研究发现，当尿素产生速率相等时，与羯羊相比，羔羊血浆尿素氮维持较高水平，而胃肠道尿素降解速率显著较快。HCO3-有利于瘤胃上皮对氨的吸收。Remond 等研究发现，充入CO2 可使通过瘤胃壁的氨净转移量增加16%。另外，动物的生理状态、胃肠道渗透压和激素等因素也会影响氨的产生、吸收与尿素循环，如瘤胃渗透压的增加会降低氨的吸收。反刍动物体内氨的产生、吸收与尿素循环的研究方法目前，通常用 2 种方法来研究反刍动物与非反刍动物含氮化合物的循环与周转，即同位素示踪技术与动静脉插管技术。 前者的基本原理是， 利用在化学性质上完全一样的标记化合物与相应的非标记化合物， 两者一经混合用化学法就不能分离， 只是放射比度有所降低， 降低程度与相应的非标记化合物。的数量 （或浓度）成正比，这样根据放射性比度的变化就可测量非标记同种化合物的含量。 后者的基本原理是， 假定除肺外所有动脉血的养分浓度是相等的，故可给实验动物安装门静脉、肠系膜静脉、动脉插管，并经肠系膜静脉灌注不为动物代谢的物质作为标记物， 再测定门静脉和颈动脉血液中该标记物的浓度， 以计算血流速度以及营养物质的变化程度。1、同位素示踪技术同位素示踪技术 首先假设动物处于稳定状态， 即代谢库保持不变， 库内物质的流入和流出速度相等，用14C-尿素、15N-尿素、15N-硫酸氨等同位素标记物来定量研究反刍动物氮素消化代谢。示踪物质的灌注方法分一次性灌注和连续灌注2 种。理论上，若能精确确定富集度-时间曲线的初始部分，则从这2 种灌注方法可得到同样的信息。实际上，连续灌注法不易精确测定代谢库大小、总流速和再循环率等，这主要是因为在连续灌注的初始部分，样品的富集度太低， 测定误差大于同样测定条件下的一次性灌注法， 致使拟合的曲线方程精确度不高。 在连续灌注法中， 根据示踪剂的灌注速率和平台期的富集度可得出不可逆损失率。因此，经过足够长时间的灌注，只需测定平台期一个样品中的氮富集度，可简化试验步骤。但在实践中，难以估计到达平台期的时间， 除非该模型是已知的， 并且连续灌注法的研究成本也较高，故目前大都采用一次性灌注15N 标记同位素的方法。采用一次性同时灌注14C-尿素和15N-尿素的方法，根据血浆尿素碳和尿素氮不可逆转消失率间的差异， 可测定尿素在肝脏中的合成量、 胃肠道降解成氨的量及随后体内重新合成的量， 这是因为由尿素水解生成的14C 经快速周转而进入较大的CO2 代谢库中， 几乎不能再参与重新合成尿素。 而采用连续灌注法时， 可通过平台期15N-氨丰度和15N-硫酸氨灌注速率， 计算瘤胃液中氨的不可逆转消失率， 也可根据平台期15N-尿素丰度或15N-细菌丰度与15N-氨丰度的比例，计算不同来源的血浆尿素氮比例或微生物氮比例。在 Fondren 等及 Mcclellang 和 Jackson 的研究基础上， Sarraseca 等又对这种测定技术加以改进。 其主要灌注15N15N-双标记尿素， 再结合对同位素15N15N、 15N14N和14N14N的分析来进行计算。 这一技术建立在如下假设的基础上， 即尿素以15N15N标记的分子形式进入胃肠道， 在细菌酶作用下分解产生两分子15N-氨， 若15N-氨分子被肝脏重吸收和排出， 又会与来自天冬氨酸的14N 在鸟氨酸循环中生成含15N14N标记的两个尿素分子， 而在鸟氨酸循环中直接或间接生成的含15N15N标记的尿素分子则忽略不计。 这一技术的详细实验程序、取样方法、数学模型在Sarraseca 等、Ruiz 等、Marini 和 Van Amburgh 的研究中已详细阐述，在此不再赘述。2、动静脉插管技术许多有关尿素循环方面的研究建立在测定内脏组织动静脉净流量差异的基础上， 这种研究需要精确的外科手术。 借助细致的外科手术，肝脏和胃肠道的代谢可被分开来研究， 尤其胃肠道可进一步分为不同部位。 目前， 这项技术不断发展和完善， 并日益成熟。 利用该技术，许多代谢产物可被准确测定，不仅包括尿素和氨，还包括AA、VFA 和葡萄糖等。反刍动物体内尿素循环的调控途径粪中排出的氮大部分是内源氮，而尿氮来源于与维持相关的不可逆损失的氮及嘌呤衍生物氮，其中不可逆损失的氮与骨骼肌中AA 的沉积量有关，主要由日粮能氮不平衡所致，嘌呤衍生物氮是由小肠吸收的微生物中的核酸降解而来。 实际上， 内源氮量远高于回肠氮流量和粪氮排出量， 只是大部分内源氮被重吸收， 而尿素循环利用是内源氮重吸收中最重要的组成部分，故粪氮排出量仅是内源氮总量的一部分。对哺乳动物而言，尿素氮在胃肠道中的转运具有重要的生理意义。有两条途径可调控每天进入尿素代谢库中的氮：一是通过减少氨吸收和AA 分解代谢来减少日粮氮转化成尿素，二是提高肝脏中合成的尿素及再循环至胃肠道的尿素转化成 MCP 的效率。Chapa 等研究发现，来源于血液中的尿素合成MCP 量与反刍动物氮进食量呈负相关。 因此， 通过调节日粮氮源来减少肝脏中尿素的合成是可能的。例如，提高日粮中RUP 的比例或降低日粮中 RDP 的比例，可提高进入小肠的氮素量，从而减少尿素的合成量。Animut 等报道，给肉牛饲喂谷物含量高和适宜 RDP 的日粮，可促进瘤胃发酵，增加进入十二指肠的AA 流量和门静脉 AA 净流量，而不影响 PDV 对能量的利用。但是，当日粮 RDP 满足反刍动物需要时， 过量的 RDP 没有任何益处。Damiran 等报道，给羔羊饲喂低能量日粮时，日粮RUP 的进食量由 40%提高到 60%，可改善氮的沉积与转化效率。 另外， 日粮中添加易发酵的能源， 能提高细菌对氮的利用效率。Huntington 认为，日粮中添加易发酵 CHO，可促进内源尿素通过瘤胃壁， 降低尿素由唾液转入瘤胃中的比例，同时减少内源尿素向肠道的转移量，从而增加瘤胃MCP 的产量。Obitsu等研究发现， 真胃灌注葡萄糖会减少尿素产量和尿氮排泄量， 随着丙氨酸中氮转化成尿素量的减少，尿素合成量也减少；同时小肠对葡萄糖的吸收增加，有利于AA 向外周组织转移，从而减少尿氮的排泄量。因此，合适的能氮平衡有利于再循环尿素氮的利用。原虫主要由鞭毛虫和纤毛虫组成，其不仅能促进日粮中蛋白的降解和瘤胃氨的迅速产生，而且能摄食并消化细菌导致氮的无效循环。王文娟等认为，去原虫能增加肠道AA 的供应，降低尿素合成，减少尿氮排泄，从而改善氮的利用。Koenig 等证实，去原虫可增加瘤胃MCP合成量和肠道细菌氮流量， 提高瘤胃氮的代谢效率。 但目前关于去原虫对反刍动物瘤胃消化代谢的影响还存在争议。再循环尿素的利用率亦可通过改变日粮结构和采食量来调控。 Huntington 等研究发现，阉牛在日粮氮和代谢能相近而精料水平不同时，当精料比例低于20%时，肝脏合成的尿素有90%参与循环；当精料比例为63%时，参与循环的尿素下降到64%；当精料比例为90%时，参与循环的尿素则占 51%。问题与展望反刍动物以氨的形式吸收日粮中大量的氮，这些氨氮在肝脏中几乎全部合成尿素。内源合成的尿素在反刍动物胃肠道内循环， 大部分被胃肠道中的细菌利用以满足其代谢需要， 再以AA、核酸和氨的形式被重吸收， 并被机体再次利用。提高日粮氮素利用效率的途径主要有两条：一是减少氨吸收和 AA 分解代谢来减少日粮氮转化成尿素，二是提高肝脏中合成的尿素及再循环至胃肠道的尿素转化成MCP 的效率。 迄今为止， 已积累了大量有关反刍动物氨的产生、吸收和尿素循环的资料,但在实际日粮条件下进行的相关研究相对较少，故在实际生产中这些资料仍很难被利用。 因此，在实际口粮配制时必须运用一些营养调控技术， 同时建立基础数据库， 并补充试验数据。 尿素循环相当复杂， 因此必须综合考虑所有的口粮影响因子，研究其动力学过程，并建立相应的动态机制模型。