冻干黄热活疫苗制造及检定规程.doc

冻干黄热活疫苗制造及检定规程冻干黄热活疫苗制造及检定规程本品系用减毒的黄热病毒 17D 株接种鸡胚，经研磨、离心，取上清液冻干制成。专供进入或经过黄热流行地区的人员预防黄热之用。1 1 毒种毒种1.1 毒种来源减毒黄热病毒 17D 株。1.2 毒种检定1.2.1 无菌试验按生物制品无菌试验规程进行。1.2.2 纯毒试验用已知黄热病毒免疫血清做中和试验，证明其为黄热病毒。1.2.3 猴体安全及效力试验取冻干黄热 17D 毒种，加无菌生理盐水恢复其原液量，接种无黄热病毒中和抗体之恒河猴 10 只，每只脑内注射0.25ml（50000 个小白鼠 LD50）。注射后第 2、4、6 日各采血 1次，分离血清，分别做 10 倍系列稀释。以原血清及 10-110-3各稀释度的血清分别脑内注射体重 1012g 小白鼠 6 只，每只0.03ml，观察 21 天，检查病毒量，LD50 均不得超过 Log2（4天以内死亡的小白鼠不计算在内）。猴子经注射后 24 周，再采血 1 次，分离血清，做中和抗体测定。10 只猴中至少要有 9只血清表现阳性中和反应。在 1 个月的观察期中，发现脑炎症状或因而死亡者不得超过 1 只猴。1.3 毒种保存原毒种和生产毒种批均应冻干后真空封口，保存于-70以下。1.4 毒种传代和生产毒种的制备取毒种 3 支，启开安瓿后立即以稀释液（不应含有任何人体蛋白和外源血清或抗体）溶化。待全部溶化后接种于 7 日龄鸡胚卵黄囊，每胚 0.2ml。分 2 组进行，每组不得少于 10 胚，置 37.538培育。7080 小时按组收取活存鸡胚，每组不得少于 4 胚。去眼后分组混合研磨，加稀释液做成悬液，经2000r/min 离心 10 分钟，吸取上清液，在鸡胚中传代，并抽样按生物制品无菌试验规程进行无菌试验。按同法连续传递2 代，传代时可不等无菌试验结果，第 3 代毒种的鸡胚收获后，吸取容器内液体做无菌试验（方法同上），并将鸡胚冻存于-40以下。将无菌试验阴性之鸡胚取出融化。按每胚加入 1ml稀释液研磨，经 2000r/min 离心 10 分钟，吸取上清液，加入稀释液稀释 5 倍后置冰浴中待用。同时做毒力滴定。此代即为生产毒种。2 2 疫苗制造疫苗制造2.1 接种鸡胚用 7 日龄鸡胚，每胚接种适当稀释度毒种液 0.10.2ml 于卵黄囊，接种后滴蜡封口。2.2 培育接种后 37.538培育，7080 小时开始收获。2.3 收获收获时剔去死胚，分组收获活存鸡胚，去眼，装入大管中，逐管吸取管内液体做无菌试验，在操作过程中盛鸡胚之大管应置冰浴中保冷，收获完毕置-40冻存。2.4 研磨、离心2.4.1 研磨剔除洒菌鸡胚，将冰冻鸡胚大管置冷水中融化，倒入研磨桶内，按每胚 1ml 加入灭菌双蒸水，用电动研磨机 8000r/min研磨 3 分钟。2.4.2 离心，收取上清液将研磨后的鸡胚悬液以减压虹吸法分装于 500ml 瓶中，塞以胶塞，用 2000r/min 离心 30 分钟。离心应在 25进行。收取上清液，每批装一个球瓶，换以胶塞，保存在冰浴中。2.5 半成品检定2.5.1 无菌试验按生物制品无菌试验规程进行2.5.2 冻干前病毒滴定吸取球瓶中样品，作 10 倍系列稀释。取 10-110-6 之病毒液，每个稀释度用体重 1012g 小白鼠 6 只，每只脑内注射0.03ml，接种部位忌用碘酒消毒，观察 21 天，计算 LD50。2.6 分装疫苗保存在冰浴中进行分装，每安瓿分装量为 0.5ml（10人份）。分装后将盛安瓿之金属盒放入-40-50预冻 2 小时。2.7 冻干全部冻干过程为 1517 小时，最后 5 小时升温 2025，最高不得超过 25。冻干后安瓿真空封口。3 3 成品检定成品检定3.1 物理检查外观为略带粉红色的疏松体，水分不应超过 3%（g/g），加入稀释液应迅速溶解。3.2 无菌试验按生物制品无菌试验规程进行。3.3 猴体安全及效力试验方法及要求见 1.2.3 项，如生产毒种做过猴体安全及效力试验则疫苗可免做。3.4 豚鼠安全试验按原分装量加入生理盐水溶解疫苗，用体重 300500g 豚鼠 2 只，试验前 23 天每天量体温、称体重。然后每只腹腔注射 0.5ml，观察 7 天，每天量体温，应无病症发生。如 2 只豚鼠均有显著反应（体温超过 40，体重减轻）或死亡，则该批疫苗应废弃；如有 1 只豚鼠有症症发生，可再用 3 只豚鼠重试，重试中如有 2 只以上豚鼠发病时，判为不合格，制品应废弃；如有 1 只发病，则再重试，仍有发病则判为不合格，制品应废弃。3.5 病毒滴定同半成品检定。每只小白鼠脑内注射 0.03ml。病毒滴度应3.66LogLD50。3.6 稳定性试验由每批疫苗成品取 3 安瓿，置 372 周，滴度下降不应超过 1Log。3.7 鉴别试验每亚批成品应按 1.2.2 项进行鉴别试验。3.8 稀释液氯化钠注射液，其质量应符合中国药典规定。4 4 保存与效期保存与效期应保存于-20，自干燥之日起效期为 1 年半，如保存于28，效期为 6 个月。