冻干基因工程α1b干扰素制造及检定规程.doc

冻干基因工程冻干基因工程 1b1b 干扰素制造及检定规程干扰素制造及检定规程本品系用从健康人白细胞中获得的 1b 干扰素基因重组质粒，转染大肠杆菌，使之高效表达人 1b 干扰素，经高度纯化后冻干制成。用于治疗慢性乙型肝炎、丙型肝炎和毛细胞白血病等疾病。1 1 菌种菌种1.1 菌种来源系带有人 1b 干扰素基因的 pBVX1b 质粒转化的大肠杆菌 JM103 株。投产的工程菌需经卫生部批准。1.2 菌种特性菌种表达稳定，表达水平符合投产菌种要求。1.3 制造用菌种库的建立从原始菌种库传出，经扩大后冻干保存，或由上一代制造用菌种库传出，扩大后冻干保存作为制造用菌种库，但每次只限传三代。每批制造用菌种库均应进行下列检定，合格后方可投产。1.3.1 划种 LB 琼脂平板应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。1.3.2 涂片革兰氏染色在光学显微镜下观察应为典型的革兰氏阴性杆菌。1.3.3 对抗生素的抗性应与原始菌种相符。1.3.4 电镜检查应为典型大肠杆菌形态，排除支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。1.3.5 生化反应应符合大肠杆菌生物学性状。1.3.6 干扰素表达量在摇床中培养，应符合原始菌种的表达量。1.3.7 表达的干扰素型别应用标准抗 型干扰素血清作中和试验，证明型别无误。1.3.8 质粒检查应做该质粒的酶切图谱，应与原始质粒相符。1.4 种子液制备1.4.1 菌种传代用 LB 培养基液体 LB 培养基不含琼脂，供摇床培养用，含 2%琼脂供制备平板和斜面用，含 0.5%琼脂的半固体供短期保存菌种用。1.4.2 生产菌种的制备和检定取制造用菌种库冻干菌种，开启后划种培养基平板 23 块，培养后挑取平板中典型集落 810 个，分别培养后保存，然后分别进行干扰素表达量测定，至少重复一次，先其中干扰素表达量最高的一份供生产制备种子液用，其表达量应符合原始菌种库的表达量，所表达的干扰素应用标准抗 型干扰素血清作中和试验，证明型别无误。1.4.3 种子液的制备将菌种接种 M9CA 培养基，在摇床中培养至 OD 值在 0.40.8之间即可供发酵罐接种用。种子液应进行质粒稳定性检查。2 2 发酵发酵2.1 每次发酵前必须进行一次空罐灭菌。2.2 发酵用 GMD 培养基，用蒸馏水配制，其中不含有任何抗生素，配制后进行实罐灭菌。2.3 发酵温度为 36.5±0.1，根据工程菌生长情况到后期可适当调整温度，并作必要的培养基成分添加，发酵时间根据工程菌生长情况确定。发酵结束时放出菌液，发酵灌应再进行一次灭菌并清洗。3 3 收菌收菌用离心法收取菌体，称重，容器上标明批号、罐别、重量、日期。收获的菌体如在 24 小时内破菌裂解可保存于 48冷库，否则应置?/FONT>30冻存。4 4 菌体裂解与粗制干扰素制备菌体裂解与粗制干扰素制备用高压匀浆法裂解菌体，将菌体作成 10%20%的悬液进行高压匀浆，压力 50Mpa/cm2，连续匀浆二次，匀浆后的悬液离心后取上清即为粗制干扰素。5 5 浓缩与纯化浓缩与纯化5.1 初步纯化采用不同原理多步骤的方法，使初步纯化的干扰素达到外观无色透明，无絮状物，比活性在 105IU/mg 蛋白以上，并将其浓缩至原体积的 1/101/20，保存于 4，如 3 天内不能进行高度纯化，应冻存于?/FONT>30冰箱内。5.2 高度纯化经初步纯化后进行高度纯化，去除绝大部分非干扰素蛋白，使其达到本规程 78 项要求。高度纯化应在洁净度为 10000 级的恒温（1518）室内进行。5.3 在高度纯化过程中应进一步浓缩，使体积为初步纯化干扰素的 1/51/10。并应转换缓冲液系统，使之适合于人体注射用。5.4 在整个浓缩与纯化过程中不得加入对人体有害的物质。5.5 在浓缩纯化过程中应特别注意去除热原质，用于分子筛层析的溶液，配合后应进行去除热原质处理。容器应干热灭菌，不能干热灭菌者应用适当浓度的 NaOH 处理。5.6 浓缩纯化最后所得的纯化干扰素即为“半成品原液”，取样进行 7.17.4 项检定后，立即加入人白蛋白，使其最终含量为 2%，称为“加白蛋白半成品”，取样测定干扰素效价，其余冻存于30冰箱中，应尽量避免冻融。5.7 所用的人白蛋白应符合相应规程要求，HBsAg。6 6 稀释、除菌过滤稀释、除菌过滤6.1 将检定合格的加白蛋白半成品以乳径为 0.22m 的滤膜除菌过滤，除菌后立即进行稀释。6.2 稀释液制备用合格的蒸馏配制生理盐水，经高压灭菌，加入检定合格的注射用人白蛋白，使最终含量为 2%，即为稀释液。配制后应立即用于稀释。6.3 稀释除菌后加白蛋白半成品用稀释液稀释至所需浓度。稀释后用孔径为 0.22m 滤膜过滤除菌，保存于 4，并取样作无菌试验和热原试验，合格后进行冻干。7 7 半成品检定半成品检定每批半成品抽样进行 7.17.7 项检定。启开新菌种生产的前 3 批或生产条件有较大改变时进行 7.87.12 项检定。7.1 效价测定用细胞病变抑制法，Wish 细胞/VSV 为检测系统。用国家参考品校准为 IU。7.2 蛋白含量用 Lowry 法测定。同批不同阶段的样品比较时应尽可能同时测定。7.3 比活性根据效价测定及蛋白含量计算比活性，本品的比活性应在107IU/mg 蛋白以上。7.4 纯度7.4.1 电泳纯度用非还原型 SDS?/FONT>PAGE 法，加样量不低于 5g，经扫描仪扫描，纯度应在 95%以上，聚合体不得超过 10%。7.4.2 高效液相色谱纯度用 280nm 检测，应呈一个吸收峰，或主峰占总面积 95%以上。7.5 分子量测定用还原型 SDS?/FONT>PAGE 法。加样量不低于 5g。制品的分子量与理论值比较，误差不超过 10%。7.6 残余外源性 DNA 含量用固相斑点杂效法，以地高辛标记的核酸探针法测定，其含量应少于 100pg/剂量。7.7 残余 IgG 含量如采用单克隆抗体亲和层析法纯化，应进行本项检定。采用 ELISA 双抗体夹心法测定，IgG 含量应少于 100ng/剂量。7.8 残余工程菌蛋白含量用酶标法或其他敏感方法测定，残余工程菌蛋白不得超过总蛋白的 0.02%.7.9 抗生素活性半成品中不应有残余氨苄青霉素活性。7.10 肽图测定应符合 1 干扰素的图形，批与批之间图形应一致。7.11 等电聚集测定等电点，应有固定的范围（4.06.5 之间）。7.12 紫外光谱扫描检查半成品的光谱吸收值，批与批之间应一致，应有固定的最大吸收值。8 8 除菌半成品检定除菌半成品检定8.1 效价测定同 7.1 项。8.2 无菌试验按生物制品无菌试验规程进行。8.3 热原质试验按生物制品热原质试验规程进行。每只家兔静脉注射干扰素 5 万，判定标准按该规程 4.1 项要求进行。9 9 成品检定成品检定9.1 处观应为微黄色薄壳状疏松体，加入 1ml 蒸馏水后溶解迅速，不得含有肉眼可见的不溶物。9.2 pH 值pH 值应为 6.57.5。9.3 无菌试验同 8.2 项。每批抽样不少于 10 支。9.4 水分应3%。9.5 热原质试验同 8.3 项。9.6 价测定同 7.1 项。效价应为标示量的 80%150%。9.7 安全试验9.7.1 豚鼠试验用体重 300400g 豚鼠 2 只，每只腹侧皮下注射 1ml（于1ml 生理盐水内），观察 7 天，豚鼠应健存，每只体重增加判为合格。9.7.2 小白鼠试验用体重 1820g 小白鼠 5 只，每只腹腔注射 0.5ml（于0.5ml 生理盐水内），观察 7 天，动物应健存，每只体重增加判为合格。1010 规格规格10g/瓶，20g/瓶和 30g/瓶。11 保存与效期保存于 28，自效价检定合格之日起效期为 2 年 6 个月。