冻干基因工程α2a干扰素制造及检定规程.doc

冻干基因工程冻干基因工程 2a2a 干扰素制造及检定规程干扰素制造及检定规程本品系用带有人 2a 型干扰素基因重组质粒的大肠杆菌，经发酵培养及单克隆抗体亲和层析后精制而成。用于治疗某些病毒性疾病及部分肿瘤疾病。1 1 菌种菌种1.1 菌种来源基因工程 2a 干扰素工程菌由带有人 2a 干扰素基因的重组质粒转化大肠杆菌而来。投产的工程菌需经卫生部批准。1.2 菌种特性菌种表达稳定，表达水平符合投产菌种要求。1.3 制造用菌种库的建立从原始菌种库传出，经扩大后冻干保存，或由上一代制造用菌种库传出，扩大后冻干保存作为制造用菌种库，但每次只限传三代。每批制造用菌种库均进行下列检定，合格后方可投产。1.3.1 划种 LB 琼脂平板应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。1.3.2 涂片革兰氏染色在光学显微镜下观察，应为典型的革兰氏阴性杆菌。1.3.3 对抗生素的抗性应与原始菌株相符。1.3.4 电镜检查应为典型大肠杆菌形态，并证明无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。1.3.5 生化反应应符合大肠杆菌生物学性状。1.3.6 干扰素的表达量在摇床培养，应符合原始菌种的表达量。1.3.7 质粒检查应做该质粒的酶切图谱，并应与原始质粒相符。1.3.8 表达的干扰素型别应用标准抗 干扰素血清做中和试验，证明型别正确。1.4 生产菌种从制造用菌种库传出供生产用的菌种，称为生产菌种。1.4.1 生产菌种的制备及检定取制造用菌种库冻干菌种开启后划种 LB 平板 23 块，培养后挑取平板中 510 个菌落，分别培养后保存，然后每个菌落分别进行干扰素表达量测定，至少重复一次，选出其中干扰素表达量最高的一份，供生产制备种子液用，其表达量应符合原始菌种的表达量。1.5 种子液从生产菌种选出的菌种供做发酵用的称“种子液”。种子液的制备：将 1.4.1 项检定合格的生产菌种，根据实际需要做扩充传代，作为罐培养的种子液。2 2 发酵培养发酵培养2.1 空罐灭菌和实罐灭菌严格按照使用说明书要求操作。2.2 发酵培养基应为适于发酵培养的培养基，根据菌种的抗生素抗性，培养若中允许加入少量抗生素，但应尽量避免含有 椖邗防嗫股亍?/P>2.3 发酵培养参数根据工程菌和发酵工艺要求设置和变换各项培养参数。3 3 收集菌体收集菌体用离心法或其他适宜方法收集菌体，菌体可在?/FONT>20下保存 1 年。4 4 菌体裂解菌体裂解用盐酸胍或溶菌酶或高压匀浆泵等适宜方法裂解菌体。5 5 制备粗制干扰素制备粗制干扰素菌体裂解后经离心所得上清液即为粗制干扰素。6 6 纯化纯化粗制干扰素经单克隆抗体亲和层析等纯化步骤后即精制成“干扰素半成品原液”。7 7 加白蛋白加白蛋白取干扰素半成品原液检定合格后，立即另入适量人白蛋白保护剂，即为“加人白蛋白半成品”，保存于?/FONT>30。8 8 稀释、除菌过滤稀释、除菌过滤将“加人白蛋白半成品”用无热原生理盐水稀释至所需浓度，补加人白蛋白，使最终含量 1%2%。然后用 0.22m 孔径滤膜除菌，除菌后抽样进行干扰素效价测定，热原质试验和无菌试验，合格后进行分装冻干。9 9 分装、冻干分装、冻干9.1 每支安瓿分装 1ml，内含 2a 干扰素 100 或 300 万IU。9.2 冻干过程制品温度不得超过 33。9.3 冻干后成品置 10以下干燥处保存，成品检定合格后进行包装。1010 半成品检定半成品检定每批半成品抽样进行 10.110.8 项检定。启开新菌种生产的前 3 批或生产条件有较大改变时进行 10.910.12 项检定。10.1 效价测定用细胞病变抑制法，Wish 细胞/VSV 为基本检测系统，用国家参考品校准为 IU。10.2 蛋白含量用 Lowry 法测定。10.3 比活性应108Iumg 蛋白。10.4 纯度10.4.1 电泳纯度用非还原型 SDS?/FONT>PAGE 法，加样量不低于 5g，经扫描仪扫描纯度应在 95%以上，聚合体不得超过 10%。10.4.2 高效液相色谱纯度用 280nm 检测，应是一个吸收峰或主峰占总面积 95%以上。10.5 分子量用还原型 SDS?/FONT>PAGE 法，加样量不低于 5g，2a干扰素分子量应为 19KD±10%。10.6 残余外源性 DNA 含量用同位素或生物素标记探针法测定，每剂量中残余外源性DNA 应低于 100pg。10.7 残余鼠 IgG 含量用酶标或其他敏感方法测定，每剂量（20g）的鼠 IgG 含量应在 100ng 以下。10.8 残余工程菌蛋白含量用酶标或其他敏感方法测定，残余工程菌蛋白不得超过总蛋白的 0.02%。10.9 残留抗生素活性半成品中不应有残余抗生素活性存在。10.10 肽图测定应符合 2a 型干扰素图形，批与批之间图形应一致。10.11 等电聚集测定等电点，2a 型干扰素等电点应 5.76.7 范围内。10.12 紫外光谱扫描检查半成品的吸收光谱，批与批之间应一致，2a 干扰素的最大吸收光谱应为 280±3nm。1111 除菌半成品检定除菌半成品检定11.1 效价测定同 10.1 项。11.2 无菌试验按生物制品无菌试验规程进行。11.3 热原质试验按生物制品热原质试验规程进行，注射剂量按家兔体重注射 20 万 IU/kg，判定标准按该规程 4.1 项要求进行。1212 成品检定成品检定12.1 外观应为白色或微黄色疏松体，另入 1ml 灭菌注射用水溶解后，不得含有肉眼可见的不溶物。12.2 pH 值pH 值应为 6.57.5。12.3 效价测定同 10.1 项。其效价应为标示量的 80%150%。12.4 水分含量应3%（g/g）。12.5 鉴别试验用中和试验法，其抗病毒活性能被抗 2a 型干扰素血清所中和或用免疫印染法。12.6 HBsAg 检测用敏感度为 1ng/ml 以下的试剂盒测定，应为阴性。12.7 无菌试验同 11.2 项，每批抽样不少于 10 支。12.8 热原质试验同 11.3 项。安全试验12.9.1 豚鼠试验用体重 300400g 豚鼠 2 只，每只腹侧皮下注射干扰素1ml，观察 7 天，局部无红肿、坏死、体重增加者为合格。12.9.2 小白鼠试验用体重 1820g 小白鼠 5 只，每只腹腔注射干扰素0.5ml，观察 7 天，动物全部存活，每只体重增加判为合格。1313 保存与效期保存与效期保存于 10以下干燥处。自效价检定合格之日起效期为 2年 6 个月。