冻干精制人白细胞干扰素制造及检定规程.doc

冻干精制人白细胞干扰素制造及检定规程冻干精制人白细胞干扰素制造及检定规程本品系用特定的诱生剂诱导健康人白细胞，经提取后制成的冻干干扰素注射剂。用于某些病毒性疾病和肿瘤的辅助治疗，对免疫缺陷性疾病也有一定疗效。1 1 制造制造1.1 制造要求1.1.1 白细胞献血员供血应符合献血员体检及化验标准。一次供血不超过 400ml，供全血间隔在 3 个月以上。白细胞的分离，应在采血后 48 小时内进行。活细胞数应达到 90%以上。1.1.2 诱生病毒采用新城疫病毒（NDV）F 株或仙台病毒，经检定血凝效价达到适宜滴度，方可投产。1.1.3 培养液采用 RPMI-1640，内含适量人血清和庆大霉素或卡那霉素。不得使用 椖邗防嗫股亍部捎闷渌室伺嘌骸?/P>1.1.4 制造工作室的设置，应符合工艺流程要求。冷库及各种生产用具，必须专用，严禁与其他异种蛋白质混用。制造工作室建筑应便于清洁、消毒、防霉。在制造过程中，应采取各种有效措施，防止细菌及热原质污染。直接接触制品的用具，用后应立即洗净，用前应除热原质及灭菌处理。1.1.5 生产用水应符合饮用水标准，直接用于制品的水应符合注射用水标准。所用各种化学药品应符合中国生物制品主要原材料试行标准规定，未纳入试行标准者应不低于分析纯。1.2 制造工艺1.2.1 诱生病毒采用 910 日龄健康鸡胚，于尿囊腔接种适量病毒，37培养 4872 小时，鸡胚发育良好，病毒达到适宜滴度后，收集尿囊液，并做无菌试验，合格后合并，抽样做滴度测定，放?/FONT>20待用。亦可用其他适宜方法制备诱生病毒。1.2.2 白细胞悬液用离心法分离血浆，吸取白细胞层，用氯化铵液裂解红细胞，或用其他适宜方法分离白细胞。然后用培养液稀释，以每ml 含活细胞 1.0×107 为宜。1.2.3 起动与诱生白细胞悬液中加入少许白细胞干扰素，于 37水浴搅拌培育 2 小时，加入适量诱生病毒，待干扰素效价达到最高峰时，收集上清，即为粗制干扰素，置?/FONT>20保存。1.2.4 纯化在粗制干扰素（效价应在 1.0×104IU 以上）中加入硫氰酸钾盐析，然后分别在酸性和碱性条件下用乙醇分级沉淀，去除杂蛋白，再用硫氰酸钾提纯一次。亦可采用经卫生部批准的其他适宜方法。1.2.5 溶解、透析或超滤检查硫氰酸钾为阴性，除菌过滤后进行半成品检定。合格后方可分装、冻干。1.2.6 半成品检定半成品应做理化检查和比活性测定，比活性应1.0×106IU/mg 蛋白。加入人血白蛋白作保护剂后，应做无菌试验、安全试验和热原质试验。试验方法及判定标准同成品检定。1.2.7 冻干按人血白蛋白（低温乙醇法）制造及检定规程1.2.5项规定进行冻干，但制品温度不得超过 35。2 2 成品检定成品检定2.1 外观本品应为白色或淡黄色疏松体，加水溶解后，为无色或淡黄色澄清液体，不得有摇不散的颗粒。2.2 化学检定按生物制品化学检定规程进行。2.2.1 水分测定水分含量应3%（g/g）。2.2.2 pH 值pH 值应为 6.87.8。2.2.3 硫氰酸钾残余量测定。取 2 滴干扰素原液加 2 滴 9%三氯化铁溶液，不呈现微红色为合格。2.3 无菌试验按生物制品无菌试验规程进行。每批抽样品不少于 10支。2.4 热原质试验按生物制品热 原质试验规程进行。每只家兔静脉注射 0.2ml（2×105IU）。判定标准按该规程 4.1 项要求进行。2.5 全试验2.5.1 豚鼠试验用体重 300400g 豚鼠 2 只，每只腹侧皮下注射干扰素1ml（1.0×106IU），观察 7 天，动特健存，每只体重增加者为合格。如不符合上述要求，用 4 只豚鼠复试一次，判定标准同前。2.5.2 小白鼠试验用体重 1820g 小白鼠 5 只，每只腹腔注射干扰素0.5ml（5×105IU），半小时内动物不应有明显的异常反应，继续观察 7 天，动物均健存，每只体重增加者判为合格。如不符合上述要求，用 10 只小白鼠复试一次，判定标准同前。2.6 HBsAg 检测每安瓿冻干制品（1ml 装）加 0.1ml 灭菌注射用水溶解，用敏感性为 1ng/ml 以下的试剂盒测定，应为阴性。2.7 效价测定按附录方法测定，应为标示量的 80%150%。2.8 残余牛血清蛋白含量测定如采用组织培养法制备诱生病毒，则成品中残余牛血清蛋白含量应50ng/支。3 3 规格规格1.0×106IU/支4 保存与效期应保存于 10以下。有效期自品效价检定合格之日起为1.5 年。附录附录 干扰素效价测定干扰素效价测定采用 CPE（细胞致病效应）抑制为基础的抑制微量测定法，以每 ml 干扰素检品的最高稀释度仍能保护半数细胞（50）免受病毒攻击的稀释度的倒数定为干扰素单位。以国际单位（IU）表示，并用国家标准品校正结果。1 1 细胞培养细胞培养将新鲜传代 2448 小时的 Wish 细胞（人羊膜细胞）以约35 万/ml 的浓度另入 96 孔组织培养板上，每孔 100l，置375%CO2孵箱中培养 46 小时。2 2 样品稀释与细胞混合样品稀释与细胞混合干扰素检品做 4 倍系列稀释，每份检品做 6 个稀释度（如100 万单位，则测 4-124-7）每个稀释度加 2 孔，与培养板中的细胞等量混合，置 375%CO25%CO2孵箱培养 1824 小时。3 3 加病毒加病毒倒掉培养板中的上清液，以 100CCID50/ml 的浓度加入VSV（水泡性口腔炎病毒），每孔 100l，375%CO2孵箱培养24 小时左右。4 4 观察结果观察结果显微镜下观察细胞病变，若病毒对照各孔细胞出现75%1000%的明显病变和死亡（变圆、死亡、脱落（，而细胞对照组中的细胞仍生长良好（病变=0），则表明对照系统合格，结果成立。5 5 计算计算通常可按 Reed?/FONT>Muench 法计算，其步骤如下：（1）计算保护百分比累积数比例 稀释度病变平均值（每孔）正常平均值（每孔）病变正常正常/病变+正常百分比（%）4-1041313/131004-2039/91004-3125/6834-4222/5404-5404-64011（2）求出干扰素单位距离比=（·高于 50%的百分数50）/（高于 50%的百分数低分 50%百分数）=（8350）/（8340）=33/43=0.77即此批干扰素稀释到即此批干扰素稀释到 4-34-3。7777（11861186）时能保护半数细）时能保护半数细胞免受攻击病毒损害。此批干扰素效价为胞免受攻击病毒损害。此批干扰素效价为 186186 单位，经国家标单位，经国家标准品修正，得出干扰素的国际单位（以准品修正，得出干扰素的国际单位（以 IUIU 表示）表示）