冻干流行性乙型脑炎活疫苗制造及检定规程.doc

冻干流行性乙型脑炎活疫苗制造及检定规程冻干流行性乙型脑炎活疫苗制造及检定规程本品系将流行性乙型脑炎（下称乙脑）SA14-14-2 减毒株病毒接种于原代地鼠肾单层细胞，经培育后收获病毒液，加保护剂冻干制成。用于预防乙脑。1 1 毒种毒种1.1 毒种来源乙脑 SA14-14-2 减毒株病毒。由中国药品生物制品检定所检定与分发。该毒株经用乙脑敏感动物试验证明其嗜神经毒力减弱，经检查无外源因子存在，用乙脑特异性免疫血清做中和试验证实为乙脑病毒，并经免疫力试验证明具有免疫原性，经临床观察证明安全有效。1.2 生产毒种批制备毒种启封后，在地鼠肾单层细胞上增殖传递，传递代数不得超过 3 代。从原始毒种算起，总代数不是超过 10 代。在传代细胞病变明显时收获病毒液，经检定合格后为生产毒种批。1.3 毒种检定1.3.1 无菌试验按生物制品无菌试验规程进行。1.3.2 支原体检查按生物制品无菌试验规程进行。1.3.3 病毒滴定抽样品做 10 倍系列稀释，取 10-4、10-5、10-6 三个稀释度的病毒液，分别接种 BHK21 细胞，用蚀斑法进行滴定，病毒滴度7.2LogPFU/1.0ml 为合格。冻干毒种批的滴度5.7LogPFU/1.0ml 为合格。做病毒滴定同时应用参考苗进行滴定，以判断试验结果是否成立。1.3.4 纯毒试验生产毒种批与非同源性乙脑高价免疫血清混合，置 3790分钟，接种地鼠肾单层细胞或 BHK21 细胞进行中和试验，观察57 天判定结果。乙脑病毒完全被中和（无细胞病变或蚀斑出现）为合格，如仍有病变或蚀斑出现，应按上述方法再行中和。1.3.5 脑内致病力试验生产毒种批原液接种体重 1214g 小白鼠 10 只，每只脑内注射 0.03ml，接种后 3 天内死亡者不计，观察 14 天应活存。3天后如有小白鼠发病，应杀死取脑测定致病力，对小白鼠的脑内毒力不应超过 3.0LogLD50/0.03ml，同时小白鼠皮下注射0.1ml10-1 病鼠脑悬液进行皮下致病力试验，观察 14 天，应健存。1.3.6 皮下感染人脑试验生产毒种批原液接种体重 1012g 小白鼠 10 只，每只皮下注射 0.1ml，同时右侧脑内空刺，观察 14 天，应健存。1.3.7 乳鼠传代返祖试验生产毒种批原液接种 35 日龄乳鼠 10 只，每只脑内注射0.02ml。将发病的乳鼠杀死 3 只，解剖取脑测其致病力，用体重 1214g 小白鼠测定，脑内毒力不应超过3.0LogLD50/0.03ml，同时皮下注射 10 只小白鼠，每只0.1ml10-1 乳鼠脑悬液，观察 14 天，应健存。1.3.8 外源因子检查生产毒种批经非同源性乙脑高价免疫血清中和后，进行细胞培养试验。样品分别接种人二倍体细胞、BHK21 细胞、原代地鼠肾细胞，于 3335进行培育，同时做对照培育。培育7、14 天细胞应无病变，分别进行次代培育和血吸附试验；次代培育 7、14 天时亦分别观察细胞病变和进行血吸附试验。结果均无细胞病变并血吸附试验阴性为合格。血吸附试验方法：观察到期的细胞，用 0.2%0.5%鸡、豚鼠红细胞混合液于 48、2025中依次进行血吸附检查。所用红细胞于 28保存应不超过 7 天。1.3.9 细胞基质外源因子检查制备生产用种子批的细胞留取 5%10%不种毒，更换相应的维持液，置 3335培育。在培育 7、14 天时，镜下观察无细胞病变后分别做血吸附试验（方法同 1.3.8 项）。细胞无病变并血吸附试验阴性为合格。1.4 生产毒种批保存液体生产毒种批于-60保存不超过 6 个月可用于生产；冻干生产毒种批于-20以下保存 2 年内可用于生产。2 2 疫苗制造疫苗制造2.1 细胞制备2.1.1 地鼠选用 1014 日龄健康地鼠，解剖取肾。如发现肾脏异常或有乳糜状腹水，应废弃。2.1.2 疫苗生产过程中不得使用青毒素或其他 内酰胺类抗生素。2.1.3 细胞消化及培养解剖取出肾脏后剪成碎块，用适量的胰蛋白酶液消化，将分散后的细胞悬液种入培养瓶内，加入生长液，置 3637培养。细胞生长成致密单层即可接种病毒。2.1.4 外源因子检查每批细胞留取 5%10%不接种病毒，加入与生产相同维持液后置 3335培育 14 天。在培育 7、14 天时分别做血吸附试验（方法同 1.3.8 项）。在观察期内细胞无病变并血吸附试验阴性为合格。如细胞出现病变或血吸附试验阳性，由该批细胞制备的病毒原液应废弃。2.2 病毒接种和培育挑选长成致密单层的细胞，用洗液充分洗涤后加适量维持液，病毒接种量为 2.73.7LogPFU/1.0ml，置 3536培育。2.3 原液2.3.1 收获病毒液种毒后培育 72 小时以上，细胞出现明显病变时收获病毒液，澄清过滤后为原液。2.3.2 原液检定2.3.2.1 无菌试验每瓶原液分别取样做无菌试验，样品种入硫乙醇酸盐、乙良马丁和肝斜面培养基，培养 8 天判定结果。2.3.2.2 支原体检查按生物制品无菌试验规程进行。2.3.2.3 纯毒试验每一消化批应抽样进行纯毒试验。方法同 1.3.4 项。2.3.2.4 病毒滴定方法同 1.3.3 项。滴度7.2LogPFU/1.0ml 为合格。2.4 疫苗半成品2.4.1 疫苗混合检定合格的原液合并后，加适宜保护剂。每批疫苗量应不超过 15 万 ml。2.4.2 无菌试验按生物制品无菌试验规程进行2.4.3 分装和冻干疫苗应在冰浴下进行分装，采用适宜的冻干条件进行冻干。出柜后应在 15以下进行封口。3 3 成品检定成品检定3.1 外观检查冻干疫苗应为淡黄色疏松体。如稀释液后迅速溶解，溶解后应为橘红色透明液体，无异物。3.2 残余水分含量冻干疫苗残余水分应3.5%。3.3pH 值冻干疫苗用蒸馏水复溶后，pH 值应为 7.28.0。3.4 病毒滴定方法同 1.3.3 项。病毒滴度5.7LogPFU/1.0ml 为合格。3.5 热稳定性试验冻干疫苗置 377 天后进行滴定（方法同 1.3.3 项），滴度下降不应超过 1.0LogPFU/ml。3.6 无菌试验按生物制品无菌试验规程进行。3.7 安全试验3.7.1 脑内致病力试验方法及判定标准同 1.3.5 项。3.7.2 皮下感染入脑试验方法及判定标准同 1.3.6 项。3.7.3 乳鼠传代返祖试验。方法及判定标准同 1.3.7 项。3.8 毒性试验冻干疫苗每支加稀释液 2.5ml 溶解复原后，用体重1215g 小白鼠 4 只，每只腹腔注射 0.5ml。注射后密切观察，30 分钟内不应有异常反应，观察 3 天应健存。3.9 残余牛血清蛋白含量冻干疫苗每支加稀释液 2.5ml 溶解复原后，残余牛血清蛋白含量50ng/ml 为合格。4 4 疫苗稀释液疫苗稀释液pH7.47.6 灭菌磷酸盐缓冲生理盐水。每支安瓿 2.5ml。5 保存与效期疫苗自冻干后病毒滴定合格之日起，在 8以下保存效期为 1 年半，在-20保存效期为 2 年。