A群脑膜炎球菌多糖菌苗制造及检定规程.doc

A A 群脑膜炎球菌多糖菌苗制造及检定规程群脑膜炎球菌多糖菌苗制造及检定规程A 群脑膜炎球菌多糖菌苗系用 A 群脑膜炎球菌液体培养后，经提纯获得的多糖抗原冻干制成。供预防 A 群脑膜炎球菌引起的流行性脑脊髓膜炎之用。1 1 菌种菌种1.1 菌种来源制造用的菌种及检定菌种用的各种诊断血清，由中国药品生物制品检定所分发或经同意。1.2 菌种检定1.2.1 形态及培养特性将待检的菌种接种在含 10%羊血普通琼脂培养基上，脑膜炎球菌在 25不生长。3537二氧化碳的环境中培养 1620小时，涂片镜检应为革兰氏阴性双球菌，亦可有单个阴性球菌。平皿分离培养显现光滑、湿润、灰白色的菌落、菌苔易取下，在生理盐水中呈均匀混悬液。1.2.2 生化反应接种葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、果糖及蔗糖，于3537培养 57 日，发酵葡萄糖、麦芽糖，产酸不产气。1.2.3 血清学特性将在 3537培养 1620 小时的菌苔，混悬于 0.5%（ml /ml）甲醛生理盐水中，或 56加热 30 分钟杀菌后，使每 ml含菌 10 亿20 亿，与同群血清做定量凝集反应，放置3537过夜，次日再放置室温 2 小时观察结果，以肉眼可见清晰凝集现象之血清最高稀释度（+）为凝集反应效价，必须达到原血清效价之半。1.3 菌种保存1.3.1 菌种应冻干保存。冻干后抽样按上述各项要求进行检查，合格后可作为种子批菌种用于生产。1.3.2 种子批菌种可低温保存或置 28冰箱中，生产前应检查菌种的全部特性，合格后方可用于生产。2 2 制造制造2.1 菌种将生产用种子批菌种启开后，接种在 10%羊血琼脂或其他适宜培养基上，放 3537二氧化碳环境培养一般不超过 18小时，第 24 代菌种可用适宜的固体或液体培养基，3537固体培养基培养不超过 18 小时，液体培养基培养不超过 12 小时。菌种自启开后最多不能超过 5 代。2.2 培养基生产多糖菌苗可选用适宜培养基。生产用的液体培养基不应含有能与加入的十六烷基三甲基溴化铵形成沉淀的成分。培养基中不应含有对人体有害或其他过敏物质。2.3 培养采用培养罐液体培养，在培养过程中及杀菌前取样进行纯菌试验，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。培养物于对数生长期后或静止期前期收获。一般培养 68 小时（随菌种接种量及使用培养基种类的不同而异）为宜。2.4 杀菌培养物加入甲醛溶液杀菌，或加热 5610 分钟，以确保杀菌完全及不损伤流脑多糖为宜。2.5 去核酸杀菌完成后，离心去菌体收集上清液，于其中加入十六烷基三甲溴化铵，充分混匀形成沉淀。放置适当时间离心，收集沉淀物。沉淀物中加入氯化钙溶液，使其最终浓度为 1mol/L，摇动或搅拌 1 小时，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为 25%（ml/ml）。冷库静置 13 小时或过夜，离心去沉淀，收集澄清的上清液。2.6 沉淀多糖于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为 80%（ml /ml），充分振摇。使多糖沉淀，离心收集沉淀多糖，然后用无水乙醇及两酮各洗二次以上，将沉淀物（多糖粗制品）保存在-20以下待进一步提取。2.7 多糖的精制将粗制品溶解于 1/10 饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达1020mg/ml，然后按 12 容量用冷酚（100g 结晶酚溶于40ml110 饱和醋酸钠溶液）提取 23 次，提取时充分振摇。然后离心收集上清液，并用 0.1mol/L 氯化钙溶液或适宜的溶液透析。必要或有条件时也可用其他方法去除内毒素活性。再加乙醇至最终浓度为 75%80%（ml /ml）。离心收集沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗二次以上。离心后倾去上清液，用无热原蒸馏水溶解沉淀的多糖，所得溶液即为提取之多糖，经除菌过滤后，取样进行无菌试验、血清学试验及各项生化测定。提取过程应尽量在 15以下进行。提纯多糖应保存在-20或以下。3 3 半成品检定半成品检定3.1 化学测定按生物制品化学检定规程进行。每批多糖应测定固体总量，计算干重。3.1.1 蛋白质含量每批提纯多糖抗原的蛋白质含量（按重量）应小于10mg/g。按 Lowry 法，用牛血清白蛋白作对照。3.1.2 核酸含量每批提纯多糖的核酸含量（按重量）应小于 10mg/g。按分光光度法，核酸在 260nm 处的吸收系数（E1%1cm）为 200。3.1.3 O-乙酰基含量测定每批提纯多糖的 O-乙酰基含量应2mmol/g。按 Hestrin法测定。3.1.4 磷含量每批提纯多糖的磷含量应80mg/g。用钼酸胺法测定。3.2 分子大小测定每批提纯多糖的分子大小应用琼脂糖-4B 或 CL-4B 凝胶过滤法测定。Kd 值应0.40。kd 值在 0.5 以前的洗脱液多糖回收应在 65%以上。3.3 血清学特异性试验每批提纯多糖应用血凝抑制试验（或其他适宜方法）进行血清学特异性试验。A 群半成品多糖抗原在抗 A 群脑膜炎球菌抗体存在下，应特异抑制 A 群脑膜炎抗原致敏的红血球凝集。3.4 提纯多糖的蛋白、核酸及脂多糖含量若达不到要求可进行再处理。4 4 提纯多糖稀释提纯多糖稀释可用单批或多批多糖合并，然后加入无菌乳糖和无菌蒸馏水（无热原）稀释，使每人份菌苗含多糖 30g，乳糖2.53.0mg。乳糖规格应为分析纯结晶体。5 5 分装与干燥分装与干燥分装及容器的要求同生物制品分装规程。6 6 成品检定成品检定6.1 鉴别试验每批分装菌苗至少取一瓶进行鉴别试验，按 3.3 项方法进行。6.2 多糖浓度每批菌苗应检查多糖含量，每人份多糖应不少于 30g。磷含量应在 2.25g 以上。6.3 无菌试验每批菌苗应按生物制品无菌试验规程进行。6.4 安全试验6.4.1 热原质试验每批菌苗应按生物制品热原质试验规程进行，家兔注射剂量为 0.025g/kg。判定标准按该规程 4.2 项要求进行。6.4.2 毒性试验6.4.2.1 豚鼠毒性试验至少用 5 只体重 350400g 的豚鼠，每只腹腔注射 500g多糖（1ml），观察 7 天，不应引起明显症状或死亡。6.4.2.2 小白鼠毒性试验至少用 5 只体重 1820g 的小白鼠，每只腹腔注射 100g多糖（0.5ml），观察 7 天，不应引起明显症状或死亡。6.5 分子大小测定分装的菌苗至少 5 批抽一批测多糖分子大小，用琼脂糖-4B或 CL-4B 凝胶过滤法测定，kd 值应0.40。kd 值在 0.5 以前的洗脱液多糖回收率应在 65%以上。6.6 水分测定每批菌苗应测水分（费休氏法），其含量应不超过 3%。7 7 菌苗稀释液检定菌苗稀释液检定稀释菌苗用的 pH6.87.2 缓冲生理盐水应经过下列检定。7.1 无菌试验每批稀释液应按生物制品无菌试验规程进行。7.2 安全试验每批稀释液用体重 1820g 小白鼠 5 只，每只腹腔注射0.5ml，观察 7 天，应健存。7.3 热原质试验按生物制品热原质试验规程进行。8 8 保存与效期保存与效期半成品多糖保存于-20或以下，自收菌之日起效期为 5 年。冻干菌苗保存于 28，自冻干之日起效期为 2 年。