流行性乙型脑炎灭活疫苗制造及检定规程.doc

流行性乙型脑炎灭活疫苗制造及检定规程流行性乙型脑炎灭活疫苗制造及检定规程流行性乙型脑炎（下称乙脑）灭活疫苗是将乙脑病毒接种于地鼠肾细胞，培育后收获病毒液，加入甲醛溶液将病毒杀死后制成。用于预防乙脑。1 毒种1.1 毒种来源P3 株病毒，每 35 年应用新分离的乙脑流行株病毒检查P3 株的保护力，以了解该毒株的有效性。P3 株干燥毒种由中国药品生物制品检定所分发。1.2 毒种检定1.2.1 无菌试验毒种启封和每次传代后均需做无菌试验，合格者方可使用。1.2.2 病毒滴定每正代必须用体重 79g 小白鼠进行脑内滴定，滴度9.0LogLD50/1.0ml 可用于生产。1.2.3 纯毒试验生产前和生产末期用小白鼠做脑内法中和试验，以鉴定毒种的特异性。所用特异性抗血清由中国药品生物制品检定所提供。中和指数必须在 500 以上。生产过程中如对毒种发生疑问，应及时进行鉴定。1.3 毒种传代分正亚代传递。从检定所取回的干燥毒种传递不超过 15 代称正代，由正代传递一代直接用于生产称亚代。每次用于传代的毒种不得少于 3 个鼠脑。传代时选用体重 79g 健康小白鼠或乳鼠，脑内接种病毒，72 小时后选眼结膜正常，有典型痉挛战粟、肢体麻痹的小白鼠，无菌取脑并进行无菌试验。1.4 毒种保存鼠脑毒种收剖经无菌试验后立即保存于-60以下，无菌试验通过后方可使用。亦可将鼠脑毒种研磨乳化制成 10%脑悬液，分装小瓶冻存于-60以下，无菌试验合格后备用。2 疫苗制造2.1 细胞制备2.1.1 地鼠选用健康地鼠。如发现肾脏异常或有乳糜状腹水，应废弃。2.1.2 细胞消化及培养取肾剪碎，用适量的胰蛋白酶溶液消化。用营养液分散细胞，制备细胞悬液，分装培养瓶，于 37进行培养。营养液中牛血清含量不得超过 8%。2.1.3 外源因子检查每生产批细胞留 5%（或不少于 500ml）悬液作为对照细胞检查外源病毒。该细胞除不接种病毒外，细胞浓度和处理均与生产过程平行进行，至原液收获之日用显微镜观察，应无病变发生。并用 0.2%0.5%豚鼠红细胞（4保存不超过 7 天）进行血吸附试验，置 4830 分钟判定结果，再置 202530分钟再次判定结果，均应为阴性。如有可疑病变或血吸附可疑阳性，在同种细胞上继续盲传，如传出病毒，该批细胞制备的疫苗应予废弃。2.2 病毒接种和培育挑选生长良好的细胞瓶，充分淋洗细胞后加入适量维持液，接种病毒，病毒量不得7.0LogLD50/1.0ml。在适当温度下培育适当时间，弃去病毒培养液，换以新维持液，继续培育一定时间。疫苗生产过程中不得加青霉素或其他 内酰胺类抗生素。2.3 原液2.3.1 过滤选择有典型细胞病变的培养瓶，经肉眼检查无菌者进行澄清过滤，细胞质量好时，可再加入新维持液，继续培育，再次收获病毒液。2.3.2 病毒灭活过滤后的原液，于取出无菌试验和病毒滴定样品后加入甲醛溶液，其最终浓度不得超过 0.05%，置适当温度下一定时间灭活病毒。过滤后加入硫柳汞防腐剂，其最终浓度不得超过0.01%。2.3.3 原液检定2.3.3.1 无菌试验按生物制品无菌试验规程进行。2.3.3.2 病毒滴定每个滴定批代表疫苗不得超过 15 万 ml，将样品 10 倍系列稀释，取至少 3 个稀释度，每个稀释度用体重 79g 小白鼠 4只，每只脑内接种 0.03ml，逐日观察，3 日内死亡者不计，观察 14 天，滴度7.0LogLD50/1.0ml 判为合格，不合格者可重试一次。2.4 半成品2.4.1 半成品取样无菌试验合格及病毒灭活到期的疫苗原液，取样做灭活试验、效力试验和无菌试验。每次解剖的地鼠制备的疫苗为一生产批，按生产批进行检定，但每批灭活试验代表疫苗量不得超过 15 万 ml，每批效力试验代表疫苗量不得超过 100 万 ml。无菌试验按生物制品无菌试验规程进行。2.4.2 半成品检定2.4.2.1 灭活试验（1）动物法：将样品脑内接种体重 1214g 小白鼠 8 只，每只 0.03ml，同时腹腔接种 0.5ml，为第一代；7 天后将第一代小白鼠处死 3 只，取脑做成 10%悬液，脑内接种 6 只小白鼠，为第二代；7 天后将第二代小白鼠处死 3 只，同法接种 6 只小白鼠，为第三代。从接种之日起逐日观察 14 天，每代小白鼠除处死和接种后 3 日内非特异性死亡者外，全部健存为合格。若传代 3 日后有个别小白鼠死亡，应立即取死鼠脑乳化成悬液再接种 3 只小白鼠，观察 14 天，该 3 只小白鼠健存仍判为合格。如仍有小白鼠死亡，该批疫苗应重试，重试合格后仍可使用。若传出活病毒应重试，查明原因。必要时继续灭活并进行灭活试验，若仍传出活病毒，该批半成品应予废弃。（2）细胞培养-动物法：将样品 25ml 透析 24 小时后，接种地鼠肾细胞或 BHK21 细胞，每 ml 样品接种不少于 3cm2 细胞片，置培养病毒的温度下培育 14 天，不得有细胞病变出现。到期的培养液脑内接种体重 79g 小白鼠 10 只，每只 0.03ml，观察 14 天，应全部健存。若有死亡者应查明原因或重试，重试合格者仍可使用。不合格者应废弃。以上两种灭活试验方法可任选一种。2.4.2.2 效力试验采用免疫小白鼠中和抗体测定法。中和抗体测定采用蚀斑减少试验。参考疫苗（RA 和 RB）及中和试验阳性血清由中国药品生物制品检定所提供。将被检苗（T）和参考苗（R）稀释成 132 腹腔免疫体重1214g 小白鼠 10 只，每只 0.5ml，免疫 2 次，间隔 7 天，第二次免疫后 7 天采血，分离血清，同组小白鼠血清等量混合，5630 分钟灭活，备用。稀释阳性血清、被检苗血清和参考苗血清，分别与稀释好的病毒（约 200PFU/0.4ml）等量混合，同时将稀释好的病毒再12 稀释，作为病毒对照，置 37水浴作用 90 分钟，接种 6孔板 BHK21 细胞，每孔 0.4ml，37孵育 90 分钟，加入含甲基纤维素的培养基覆盖物，于 CO2 孵箱中培育 5 天，染色，蚀斑计数，计算被检苗和参考苗组对病毒对照组的蚀斑减少率。病毒对照组的蚀斑平均数应在 50150 之间。判定标准（1）合格：T（RA+RB）/2-0.33（2）重试：（RA+RB）/2-0.66T（RA+RB）/2-0.33（3）不合格：T（RA+RB）/2-0.662.4.2.3 残余牛血清蛋白含量测定用检定所认可的试剂和方法测定，残余牛血清蛋白含量应50ng/ml。3 成品检定3.1 外观检查疫苗应为橘红色透明液体，无异物，无沉淀。3.2 无菌试验按生物制品无菌试验规程进行。3.3 化学检查按生物制品化学检定规程进行。pH 值为 7.28.0。游离甲醛不高于 0.05%，硫柳汞不高于 0.01%。3.4 安全试验每批疫苗腹腔注射体重 1820g 小白鼠 4 只，每只0.5ml，逐日观察 3 天，均应健存，如有小白鼠死亡，除检查原因外，应立即进行重试。3.5 亚硫酸氢钠检定分装后的亚硫酸氢钠要进行含量测定和无毒性试验。含量不得低于原配浓度的 60%。无毒性试验系将样品稀释成1100，腹腔注射体重 1820g 小白鼠 2 只，每只 0.5ml，观察 5 日，应全部健存。4 保存与效期保存于 28暗处。自效力检定合格之日起效期为 2 年。流行性乙型脑炎灭活疫苗使用说明书本品系将流行性乙型脑炎病毒接种地鼠肾细胞，培养后收获病毒液，另入甲醛溶液将病毒灭活后制成，为橘红色透明液体，含硫柳汞防腐剂，用于预防流行性乙型脑炎。接种对象主要为 6 个月10 周岁儿童和由非疫区进入疫区的儿童和成人。用法1.于上臂外侧三角肌附着处皮肤消毒后皮下注射。2.剂量如下：年龄组（初免）第1 针第2 针加强针（初免后 1 年）6 个月7 周岁0.5ml0.5ml0.5ml7 周岁以上1.0ml1.0ml1.0ml注：第 1 针与第 2 针间隔 710 日。为减少注射疼痛，在疫苗中可加入适量亚硫酸氢钠液，疫苗由红色变为黄色，即可注射。禁忌发热、急性疾病及严重慢性疾病、神经系统疾病、过敏性疾病和既往对抗生素、生物制品有过敏史者均不可注射。反应注射后一般无反应。个别有发热、头晕或皮疹者应注意观察，必要时给予适当治疗。注意事项1.疫苗混浊、变色、曾经冻结，安瓿有裂纹、有异物者均不可使用。2.应备有 11000 肾上腺素，以备偶尔发生休克时急救用。接受注射者在注射后应在现场休息片刻。保存应保存于 28暗处。