冻干皮上划痕人用布氏菌病活菌苗制造及检定规程.doc

冻干皮上划痕人用布氏菌病活菌苗制造及检定规程冻干皮上划痕人用布氏菌病活菌苗制造及检定规程本品系采用布氏菌弱毒菌株，经培育后冻干制成。用于预防布氏菌病。1 1 菌种菌种1.1 用弱毒牛型 104M 菌种。菌种应由中国药品生物制品检定所分发或经同意。1.2 菌种应经冻干，保存于 28，并指定专人负责保管。1.3 禁止使用通过动物后再分离培育出之菌株制造菌苗。1.4 菌种的免疫力试验每 3 年至少检定一次。1.5 菌种检定1.5.1 培养特性在含有 150000 碱性复红培养基上应生长，但在含有同样浓度的硫堇培养基上不应生长（亦可用纸片法检查），在肝琼脂斜面培养基上产生微量硫化氢。涂片镜检应为革兰氏阴性球杆菌。1.5.2 变异检查用生理盐水将新鲜培养物制成含菌数为 25 亿30 亿/ml 的菌悬液，置 90水浴中 30 分钟，不应出现凝集现象。用同样浓度的菌悬液，与 11000 三胜黄素水溶液等量混合，于 37放 24 小时，不应出现凝集现象。用结晶紫菌落染色法检查，菌落变异率不得超过 3%。1.5.3 噬菌体裂解试验将菌种接种于肝琼脂平皿上，滴加布氏菌 Tb 噬菌体 1 滴，于 37培育 4448 小时，在噬菌体流过的地方应无本菌生长。1.5.4 血清学试验用生理盐水将新鲜培养物制成含菌数为 50 亿/ml 的菌悬液，与已知效价的布氏菌诊断血清作凝集反应，其凝集价应达到血清原效价。1.5.5 残余毒力检查用生理盐水将 37培育 4448 小时之肝琼脂斜面新鲜培养物制成菌悬液，并稀释成 15 亿/ml、30 亿/ml、60 亿/ml、120 亿/ml 和 240 亿/ml 等 5 个浓度的菌悬液。取体重1820g 小白鼠 25 只分为 5 组，各组分别用不同浓度的菌悬液腹腔注射，每只 0.5ml，观察 7 天，计算 LD50，其值应为1020 亿菌。1.5.6 免疫力试验用生理盐水将菌种 1 代新鲜培养物制成浓度为 2 亿/ml 的菌悬液。取体重 300350g 豚鼠 10 只。每只皮下注射 1ml，经2530 天后，每只豚鼠皮下攻击羊型强毒布氏菌 10 个或 20 个感染量（MID）。同时取 3 组健康豚鼠作对照，每组 3 只，分别于各组豚鼠皮下注射 0.5、1 及 2 个 MID。免疫及对照豚鼠于注射毒菌悬液后均观察 2530 天后解剖，取出鼠蹊部淋巴结、腹主动脉旁淋巴结、肝及脾分别接种肝琼脂中管斜面培养基，于37培育 10 天。如免疫动物组织之培养物有布氏菌生长，应用硫堇染科培养基（亦可用纸片法）和硫化氢反应做菌型鉴别试验。注射 1 个 MID 的 3 只对照豚鼠都必须发生全身感染，即肝脏或脾脏应分离出羊型毒菌。免疫组攻击 10 个 MID 时， 10只豚鼠中不应有 2 只以上分离出羊型毒菌；攻击 20 个 MID 时，10 只豚鼠中不应有 3 只以上分离出羊型毒菌。2 2 菌苗制造菌苗制造2.1 制造菌苗的工作室应专用，不得与其他细菌工作混用。生产中应严格执行无菌操作，非制造菌苗用的其他布氏菌不得带到生产工作室内。2.2 制造菌苗可用 pH6.67.2 的肝浸液琼脂或其他适宜培养基。2.3 启开冻干菌种，接种在肝琼脂斜面或其他适宜的培养基上，放 37培育 4448 小时为第 1 代。第 1 代菌须进行1500 三胜黄素玻片凝集试验，只有光滑型菌方可用于制造菌苗。第 1 代菌种斜面于 28可保存 15 日。2.4 将第 1 代菌种接种到肝琼脂或其他适宜培养基上，放37培育 4448 小时为第 2 代菌种。经肉眼纯菌检查合格后，弃去凝固水，用无菌生理盐水制成菌悬液。2.5 将第 2 代菌种接种到琼脂或其他适宜培养基上，放37培育 4448 小时，肉眼逐瓶检查，有杂菌者废弃。2.6 用含有蔗糖、明胶、硫脲和味精组成的保护液或其他适宜的保护液洗下菌苔或刮取菌苔，放入保护液内。每数瓶培养物可采入或刮入 1 瓶（或 1 大管）保护液内，此为菌苗原液，置 28保存。每瓶（或大管）原液均按生物制品无菌试验规程进行纯菌试验。2.7 将纯菌试验合格的原液合并，如每安瓿冻干菌苗为10 人份，装量 0.5ml 原液，则应合并后的原液稀释成每 ml 含菌 1800 亿2000 亿，使每 1 人份菌苗含 90 亿100 亿。由原液采集到冷冻干燥之间隔不得超过 7 天。稀释后的原液经纯菌试验合格后即可分装安瓿冻干。2.8 同一日采集的原液同一次冻干者为 1 批。如 1 批有数瓶，应分为亚批。3 3 冷冻干燥冷冻干燥菌苗原液分装安瓿完毕后应立即在-30以下进行冷冻。干燥时间可根据水分含量及活菌数来决定。干燥完毕后进行真空封口。亦可用充氮封口。4 4 成品检定成品检定4.1 物理化学检查冻干菌苗应为乳白色疏松体，加入生理盐水后，应于 1 分钟内溶解成均匀悬液。用真空测定器检查安瓿应为真空。水分含量不得超过 3%。4.2 菌型检查每亚批菌苗应用硫堇培养基或纸片法及硫化氢反应做菌型鉴别检查，应呈牛型布氏菌的培养特性。4.3 纯菌试验每亚批菌苗抽样按生物制品无菌试验规程进行。4.4 活菌计数及菌落变异检查每亚批取 3 支安瓿，加生理盐水溶解混匀后比浊。将菌液浓度稀释为含菌 10 亿/ml，再用生理盐水做 10 倍系列稀释至10-6，取 10-6或其他适宜的稀释度之菌液接种 5 个平皿，每个平皿接种 0.1ml。用涂菌棒涂匀后放 37培育 45 天，计算活菌数。冻干后活菌率不得少于 50%，如不合格可复试，经复试仍低于 50%者则该批菌苗废弃。同时用结晶此菌落染色法检查，菌落变异率不得超过 10%。4.5 浓度测定菌苗经溶解后，按中国细菌浊度标准测定浓度，每人份含菌数应为 90 亿100 亿。4.6 安全试验每亚批取 3 支安瓿，用生理盐水溶解后混匀。用体重1820g 小白鼠 5 只，每只皮下注射 10 亿菌/ml 的菌悬液0.5ml。观察 7 日不应有死亡，如有死亡应复试一次，仍有死亡，则该批菌苗废弃。4.7 免疫力试验10 批以下者至少抽 1 批进行免疫力试验，10 批以上者，每10 批抽 1 批。用灭菌生理盐水溶解冻干菌苗，并稀释成 5 亿菌/ml 菌悬液。取体重 300350g 豚鼠 10 只，每只皮下注射1ml。经 2530 日后，每只豚鼠皮下攻击羊型线毒布氏菌 10 个或 20 个 MID。同时用 3 组健康豚鼠作对照，每组 3 只，各组豚鼠分别于皮下注射 0.5、1 和 2MID。各组不能自拔于注射毒菌悬液后 2530 日解剖，取鼠蹊部淋巴结、腹主动脉旁淋巴结、肝及脾，分别接种肝琼脂中管斜面培养基，于 37培育 10 天。如免疫动物组织之培养物有布氏菌生长，需用硫堇培养基（亦可用纸片法）和硫化氢反应做菌型鉴别试验。注射 1 个 MID 的3 只对照豚鼠都必须发生全身感染，即肝脏或脾脏应分离出羊型毒菌。攻击 10 个 MID 时，10 只免疫豚鼠中不应有 3 只以上分离出羊型毒菌；攻击 20 个 MID 时 10 只免疫豚鼠中不应有 4只以上分离出羊型毒菌。5 5 保存与效期保存与效期应保存于 28暗处。自冻干后活菌数检定合格之日起效期为 1 年。