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第八章第八章 分子荧光光谱法分子荧光光谱法光致发光和分子荧光光谱法光致发光和分子荧光光谱法 光致发光光致发光是被电磁辐射所激发并再发射是被电磁辐射所激发并再发射出波长相同或较长的辐射。荧光、磷光。出波长相同或较长的辐射。荧光、磷光。 基于化合物的荧光测量而建立起来的分基于化合物的荧光测量而建立起来的分析方法称为析方法称为分子荧光光谱法分子荧光光谱法。 分子荧光光谱法的特点是分子荧光光谱法的特点是：灵敏度高，：灵敏度高，选择性好，应用不如分光光度法广泛。选择性好，应用不如分光光度法广泛。8.1 8.1 荧光光谱法基本原理荧光光谱法基本原理 单重态单重态S 一个所有电子自旋都配一个所有电子自旋都配对的分子的电子状态。对的分子的电子状态。(抗磁性抗磁性) 大多数有机物分子的基态是单重大多数有机物分子的基态是单重态。态。 基态一对电子中的一个被激发到基态一对电子中的一个被激发到较高能级时，其自旋方向不会立刻较高能级时，其自旋方向不会立刻改变，分子仍处于单重态。改变，分子仍处于单重态。 三重态三重态T 有两个电子的自旋不配有两个电子的自旋不配对而平行的状态对而平行的状态,分子具有顺磁性。分子具有顺磁性。 8.1.1 8.1.1 分子的激发与失活分子的激发与失活1. 1. 分子的多重态分子的多重态激发三重态能量较激发单重态低。激发三重态能量较激发单重态低。2. 2. 激发态分子的失活激发态分子的失活: :激发态分子不稳定，它要以激发态分子不稳定，它要以辐射或无辐射跃迁辐射或无辐射跃迁的方式的方式回到基态。回到基态。无辐射跃迁无辐射跃迁振动弛豫振动弛豫内转换内转换系系(统统)间窜越间窜越外转换外转换辐射跃迁辐射跃迁荧光荧光 磷光磷光123456无辐射跃迁无辐射跃迁振动弛豫振动弛豫 由于分子间碰撞，激发态分由于分子间碰撞，激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级转至子由同一电子能级中的较高振动能级转至较低振动能级的过程，能量以热的形式失较低振动能级的过程，能量以热的形式失去，其效率较高。去，其效率较高。内转换内转换 相同多重态的两个电子能级相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级回到低能级的分子内过间，电子由高能级回到低能级的分子内过程程。 系系(统统)间窜越间窜越 激发态分子的电子自旋发激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发生变化的过程生倒转而使分子的多重态发生变化的过程。外转换外转换 激发态分子与溶剂或其他溶质激发态分子与溶剂或其他溶质相互作用、能量转换而使荧光（或磷光）相互作用、能量转换而使荧光（或磷光）减弱甚至消失的过程。减弱甚至消失的过程。 荧光强度的减弱或消失，称为荧光强度的减弱或消失，称为荧光熄灭（或猝灭）。荧光熄灭（或猝灭）。 凡是可使粒子间碰撞减少的条件如低凡是可使粒子间碰撞减少的条件如低温、高黏度可导致荧光增强。温、高黏度可导致荧光增强。辐射跃迁辐射跃迁荧光荧光 受光激发的分子从第一激发单重态受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动能级回到基态单重态的最低振动能级回到基态单重态(的不同振的不同振动能级动能级)所发出的辐射所发出的辐射. 因先经非辐射方式释放能量到达第一激发因先经非辐射方式释放能量到达第一激发单重态的最低振动能级，单重态的最低振动能级，因此荧光波长一般比因此荧光波长一般比激发光波长长。激发光波长长。磷光磷光 从第一激发三重态的最低振动能级从第一激发三重态的最低振动能级回到基态单重态回到基态单重态(的不同振动能级的不同振动能级)所发出所发出的辐射。的辐射。8.1.2 8.1.2 荧光强度及影响荧光的因素荧光强度及影响荧光的因素荧光是物质吸收光子之荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度后发出的辐射，荧光强度（F F）与荧光物质的）与荧光物质的吸光程吸光程度度及其及其发射荧光的能力发射荧光的能力有关。有关。1. 1. 荧光量子产率荧光量子产率 发发射射荧荧光光的的分分子子数数发发射射的的光光子子数数激激发发态态的的分分子子数数吸吸收收的的光光子子数数物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（）表示： 荧光分子的平均寿命用荧光分子的平均寿命用表示。表示。 越小表明荧光过程越快，效率高，而越小表明荧光过程越快，效率高，而其他失活过程几率较小，分子越易发荧光。其他失活过程几率较小，分子越易发荧光。 max代表吸光过程的难易。代表吸光过程的难易。 10-5 /max 对弱吸收体系，对弱吸收体系， 大，其他失活过程大，其他失活过程几率大，荧光强度减弱。几率大，荧光强度减弱。ffiecic()kkkkk 与失活过程的速率常数与失活过程的速率常数k k有关：有关： 凡是使荧光速率常数凡是使荧光速率常数kf 增大而使其他失活过增大而使其他失活过程（系间窜越、外转换、程（系间窜越、外转换、内转换）的速率常数内转换）的速率常数减小的因素都可使荧光增强减小的因素都可使荧光增强。主要取决于化学结构主要取决于化学结构受环境影响大受环境影响大2. 2. 荧光强度与浓度的关系荧光强度与浓度的关系I0入射光辐射功率；入射光辐射功率；I透射光辐射功率；透射光辐射功率；bc303. 20eII )e1(IKFbc303. 20 0()FKII发射荧光的能力发射荧光的能力吸光程度吸光程度K 取决于荧光量子产率（取决于荧光量子产率（） 当当I I0 0一定时一定时 F = Kc 即即在低浓度时在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物，溶液的荧光强度与荧光物质的浓度成正比，这是荧光法定量的基础。质的浓度成正比，这是荧光法定量的基础。 假设假设bc0.05，则：，则： 2302.3032.3032.3032!3!bcbcFKIbc bc303. 2IKF0 当当I I0 0一定时一定时 F = Kc 在高浓度时不适用在高浓度时不适用: :1.1.由于数学近似引起由于数学近似引起F向浓度轴偏离向浓度轴偏离; ;2.2.浓度大入射光被强烈吸收浓度大入射光被强烈吸收, ,溶液内部入射光减弱溶液内部入射光减弱, ,荧荧光减弱。光减弱。3.3.自猝灭自猝灭发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射转移。射转移。4.4.自吸收自吸收溶液内部激发态分子所发射的荧光在通溶液内部激发态分子所发射的荧光在通过外部溶液时被同类分子吸收。过外部溶液时被同类分子吸收。 K与与I0有关。有关。 荧光法灵敏度可通过增大光源辐射功率荧光法灵敏度可通过增大光源辐射功率I I0 0（或（或放大荧光信号）而提高。放大荧光信号）而提高。3. 3. 荧光与结构的关系荧光与结构的关系 （1）电子跃迁类型）电子跃迁类型 激发波长激发波长 250nm 发射发射 *跃迁比跃迁比*n跃迁更常见跃迁更常见（2）共轭效应）共轭效应 芳香族化合物的荧光最常见且最强，大多数未取芳香族化合物的荧光最常见且最强，大多数未取代芳烃在溶液中发荧光，随着环的数目和稠合程度增加，代芳烃在溶液中发荧光，随着环的数目和稠合程度增加，荧光峰红移，荧光峰红移，。 简单杂环化合物不发荧光（简单杂环化合物不发荧光（ *n 体系易发生系间体系易发生系间窜跃），但具有稠环结构的杂环化合物都发荧光。窜跃），但具有稠环结构的杂环化合物都发荧光。（3）平面刚性结构效应平面刚性结构效应 有有刚性结构刚性结构的分子容易发荧光，刚的分子容易发荧光，刚性和共平面性的增加有利于荧光发射。性和共平面性的增加有利于荧光发射。CH2联苯联苯 =0.2芴芴 =1 0=0（4 4）取代基的影响）取代基的影响 化合物化合物 相对荧光强度相对荧光强度 苯苯 10 10 C6H5COOHC6H5NO230C6H5CH3C6H5OHC6H5OCH3C6H5NH2C6H5CN1718202020C6H5ClC6H5BrC6H5I750 芳环上芳环上有吸电子取有吸电子取代基会妨碍代基会妨碍荧光产生荧光产生. . 卤素取卤素取代时由于代时由于重重原子效应原子效应荧荧光随卤素原光随卤素原子序数增加子序数增加而减少而减少. . 给电给电子取代基子取代基会使荧光会使荧光强度增加强度增加. . 重原子中的高核电荷，容易引发分子的电子自旋重原子中的高核电荷，容易引发分子的电子自旋与轨道运动相互作用，增加了系间串跃的几率。与轨道运动相互作用，增加了系间串跃的几率。4. 4. 影响荧光的环境因素影响荧光的环境因素 （1 1）温度降低会使荧光强度增大）温度降低会使荧光强度增大乙醇乙醇-80-800 0C C，=1.00=1.00温度每增加温度每增加1010，荧光效率减小约，荧光效率减小约3 3%。（2 2）带有酸性或碱性取代基的芳）带有酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧光与香化合物的荧光与pH有关有关化合物化合物 相对荧光相对荧光强度强度 C6H5OH 18 C6H5O 10C6H5NH2 20 +C6H5NH3 0（3 3）溶剂）溶剂 溶剂极性增加有时会使荧光强度增加（溶剂极性增加有时会使荧光强度增加（E E-减减小），荧光波长红移；小），荧光波长红移； 如：奎宁在苯、乙醇和水中的荧光效率的相对大如：奎宁在苯、乙醇和水中的荧光效率的相对大小为小为1 1：3030：10001000 若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧光物质电离状若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧光物质电离状态改变，会使荧光强度、荧光波长改变；态改变，会使荧光强度、荧光波长改变； 含重原子的溶剂（碘乙烷、四溴化碳）使荧光减含重原子的溶剂（碘乙烷、四溴化碳）使荧光减弱。弱。（4 4）溶解氧的存在往往使荧光强度降低（）溶解氧的存在往往使荧光强度降低（氧猝灭氧猝灭）。）。 光化学诱导氧化光化学诱导氧化 顺磁性氧与处于单重激发态的荧光分子作用，系间顺磁性氧与处于单重激发态的荧光分子作用，系间窜跃，使其成为顺磁性的三重态。窜跃，使其成为顺磁性的三重态。8.1.3 8.1.3 激发光谱和荧光光谱激发光谱和荧光光谱 任何荧光化合物都具有任何荧光化合物都具有两种特征光谱：两种特征光谱：激发光谱激发光谱吸收光谱吸收光谱 在在荧光最强荧光最强的波长的波长处测量不同激发光波长处测量不同激发光波长下荧光强度的变化；下荧光强度的变化；荧光光谱荧光光谱发射光谱发射光谱 固定激发光波长在固定激发光波长在最大激发波长最大激发波长下，测量下，测量不同荧光波长处荧光强不同荧光波长处荧光强度。度。Stokes位移；位移；荧光光谱和激发光谱大致荧光光谱和激发光谱大致成镜像对称成镜像对称；荧光光谱形状和峰位与激发光波长无关荧光光谱形状和峰位与激发光波长无关，无论用，无论用=250和和350nm哪一个作激发光源，所得荧光光谱形哪一个作激发光源，所得荧光光谱形状和峰的位置都是相同的状和峰的位置都是相同的。它们有三个特点：它们有三个特点：8.2 8.2 荧光分析仪器和荧光法的应用荧光分析仪器和荧光法的应用 8.2.1 8.2.1 荧光分光光度计荧光分光光度计荧光分光光度计既可用荧光分光光度计既可用于定量分析，也可用于测绘于定量分析，也可用于测绘激发光谱和荧光光谱。激发光谱和荧光光谱。 第一单色器选择激发光第一单色器选择激发光波长（波长（250nm250nm的紫外光），的紫外光），故称为激发单色器。第二单故称为激发单色器。第二单色器（荧光单色器）与激发色器（荧光单色器）与激发光光入射方向垂直入射方向垂直，并选择荧，并选择荧光波长，可提高方法的选择光波长，可提高方法的选择性和准确度。性和准确度。 8.2.2 8.2.2 荧光法的应用荧光法的应用 荧光法灵敏度高、选择性好，可用于痕量分析，荧光法灵敏度高、选择性好，可用于痕量分析，但是能发生荧光的化学体系不多，这是荧光法但是能发生荧光的化学体系不多，这是荧光法的应用特点。的应用特点。 目前可用荧光法分析近目前可用荧光法分析近70种元素。常采用荧光种元素。常采用荧光分析法的元素有：分析法的元素有：Be、B、Mg、Al、Ga、Se以及一些稀土元素。以及一些稀土元素。 无机物直接产生荧光不多，通常通过与无机物直接产生荧光不多，通常通过与荧光试剂荧光试剂作用生成荧光螯合物而进行荧光分析。作用生成荧光螯合物而进行荧光分析。 非过渡金属离子的荧光螯合物较多，荧光试剂具非过渡金属离子的荧光螯合物较多，荧光试剂具有两个（或以上）与有两个（或以上）与MZ+形成螯合物的电子给予体官形成螯合物的电子给予体官能团的芳香结构。能团的芳香结构。SO3NaN=NOH HOONOH N8-8-羟基喹啉羟基喹啉石榴石榴茜素茜素R R 荧光猝灭法：荧光猝灭法：DNA与天青与天青A作用可引起天青作用可引起天青A荧光猝灭荧光猝灭 F、S、Fe、Ag、Co、Ni、CN- 、 催化荧光法：催化荧光法：Cu、Be、Fe、Co、Os 伯胺、仲胺、酚或伯胺、仲胺、酚或氨基酸氨基酸 丹磺酰氯丹磺酰氯 某些羧酸某些羧酸 9-蒽基重氮甲烷蒽基重氮甲烷 应应 用用 结结 构构 式式 名名 称称 CH2N2N(CH3)2SO2Cl荧光法在有机化合物中应用较广。荧光法在有机化合物中应用较广。芳香化合物多能发生荧光。芳香化合物多能发生荧光。脂肪族化合物往往与荧光试剂作用后才可产生荧光。脂肪族化合物往往与荧光试剂作用后才可产生荧光。