实验7-2 丙二醛含量测定.pdf

实验 7-2丙二醛（MDA）含量测定【实验目的】1、掌握植物组织中丙二醛含量测定的原理和方法。2、了解丙二醛含量测定的意义。【实验原理】植物器官在衰老或逆境胁迫时，会发生脂质过氧化作用，丙二醛（MDA）是其终产物之一，其含量可以反映脂类过氧化程度和植物遭受逆境伤害的程度。在高温和酸性条件下，丙二醛与硫代巴比妥酸（TBA）反应，生成红棕色的 3，5，5-三甲基恶唑-2，4-二酮（三甲川） ，在 532nm 处有最大吸收波长。植物在胁迫条件下可溶性糖增加，而糖与硫代巴比妥酸的反应产物在532nm 也有吸收（最大吸收波长为450nm） ，因此测定植物组织中丙二醛含量时需排除可溶性糖的干扰。采用双组分分光光度法可分别求出丙二醛和可溶性糖的含量。蔗糖与TBA 反应产物在450 nm 和 532nm 的摩尔吸收系数分别为85.40 和 7.40；丙二醛与 TBA 反应产物在 450 nm和 532nm 的摩尔吸收系数分别为 0 和 155000， 根据 Lambert-Beer 定律， 列出二元一次方程：A450=C185.4A532- A600=C17.4+ C2155000解此方程得：C1（mmol/L）=11.71 A450C2（mol/L）=6.45（A532- A600）-0.56 A450（1）其中：C1可溶性糖的浓度C2丙二醛的浓度A450、A532、A600分别表示 450、532 和 600nm 波长下的吸光值。【实验器材与试剂】1、实验材料受逆境胁迫的植物叶片或衰老的植物器官、正常植物叶片或器官2、实验试剂10%的三氯乙酸（TCA） （称取 10 克 TCA 蒸馏水稀释定容至 100mL） 、石英砂、0.6%的硫代巴比妥酸（称取 0.6 克硫代巴比妥酸先用少量 1mol/L 氢氧化钠溶解，再用 10%三氯乙酸定容至 100mL）3、实验仪器分光光度计、离心机、研钵、电炉、试管、量筒、天平、移液管等【实验步骤】1、MDA 的提取称取材料 1g，剪碎，先加入2mL10%的三氯乙酸和少量石英砂研磨，再加入8mL10%的三氯乙酸充分研磨后， 4000r/min 离心 10min，上清液即为样品提取液。2、显色反应及测定吸取 2mL 提取液，加入 2mL0.6%的硫代巴比妥酸，混匀，于沸水浴中反应 15min，迅速冷却后离心。以 2mL 蒸馏水代替提取液作为对照。3、测定取上清液测定 532nm 、450nm 和 600nm 处的 OD 值。4、计算先按公式（1）计算样品提取液中丙二醛的含量，再根据植物组织的鲜重计算丙二醛的含量（mol/gFW ） 。【注意事项】1、MDA-TBA 显色反应的时间最好控制在10-15min 之间。时间太短或太长均会引起532nm下的光吸收值下降。2、一定要充分研磨样品以保证MDA 提取完全。【实验作业】1、正常植物组织与胁迫条件下植物组织的丙二醛含量相比有什么变化，分析其原因。2、为什么要测定反应液在600nm 下的吸光度？3、有哪些因素会影响植物组织中丙二醛含量的测定？【参考文献】1.张志良等主编.植物生理学实验指导.高等教育出版社,北京,2009.2.郝再彬等主编. 植物生理学实验.哈尔滨工业大学出版社,哈尔滨,2004.3.李合生主编. 植物生理生化实验原理和技术. 高等教育出版社,北京,2000.