DNA粗提取和鉴定复习.ppt
复习巩固:(1)如何观察DNA和RNA在真核细胞中的分布情况?(2)真核细胞DNA的主要存在场所?(3)证明DNA是遗传物质的三个经典实验?(4)DNA分子双螺旋结构模型的提出者是谁?(5)DNA分子双螺旋结构模型的主要特点?1、DNA分子由两条链分子由两条链组成组成,这两条链按反向平这两条链按反向平行的方式盘旋成双螺旋行的方式盘旋成双螺旋结构结构.2、DNA分子中的磷酸分子中的磷酸和脱氧核糖交替连接和脱氧核糖交替连接.排排列在外侧列在外侧,构成基本骨架构成基本骨架,碱基排列在内侧碱基排列在内侧.3、DNA分子两条链上分子两条链上的碱基通过氢键连接成的碱基通过氢键连接成碱基对碱基对.一、基础知识多糖、核酸、蛋白质等。多糖、核酸、蛋白质等。选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。学性质的生物大分子。利用利用DNA与与RNA、蛋白质等其他成分在不同浓度、蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，选择适当浓度使溶液中溶解度不同，选择适当浓度使DNA充分充分溶解溶解而而使杂质沉淀或者相反使使杂质沉淀或者相反使DNA析出析出，以达到提取和分离，以达到提取和分离目的。同时利用目的。同时利用DNA不溶于酒精的原理可将不溶于酒精的原理可将DNA与蛋与蛋白质等其他杂质进一步分离提取含杂质较少的白质等其他杂质进一步分离提取含杂质较少的DNA。DNA在在在NaClNaCl溶液浓度低于溶液浓度低于0.14 mol/L0.14 mol/L时，时，DNADNA的溶解度随的溶解度随NaClNaCl溶液浓度溶液浓度的 增 加 而 逐 渐 降 低 ； 在的 增 加 而 逐 渐 降 低 ； 在 0 . 1 4 0 . 1 4 mol/Lmol/L时，时，DNADNA溶解度最小；当溶解度最小；当NaClNaCl溶液浓度继续增加时，溶液浓度继续增加时，DNADNA的的溶解度又逐渐增大。溶解度又逐渐增大。当氯化钠的物质的量浓度为 2 molL时，DNA的溶解度最大，浓度为 014 molL时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出。DNADNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定一、实验原理一、实验原理 1.1.血细胞在蒸馏水中会渗透吸水过度而导致细胞膜和细血细胞在蒸馏水中会渗透吸水过度而导致细胞膜和细胞核膜的破裂。利用此特性可得到含有胞核膜的破裂。利用此特性可得到含有DNA的溶液。的溶液。2.2.DNA在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氯化钠的浓度在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氯化钠的浓度的变化而改变的。的变化而改变的。DNA在在0.14 molL的氯化钠溶液中的氯化钠溶液中的溶解度最低，的溶解度最低，利用这一原理，可以使溶解在氯化钠溶利用这一原理，可以使溶解在氯化钠溶液中的液中的DNA析出与杂质分离或用析出与杂质分离或用2 molL的氯化钠溶液的氯化钠溶液使使DNA溶解过滤除去不溶杂质溶解过滤除去不溶杂质。 3.3.DNA不溶于酒精溶液不溶于酒精溶液，但细胞中的但细胞中的某些物质则可以溶某些物质则可以溶于酒精。于酒精。利用这一原理，可以进一步利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少提取出含杂质较少的的DNA。 4.4.DNA遇二苯胺（沸水浴）会变成蓝色，因此，遇二苯胺（沸水浴）会变成蓝色，因此，二苯胺二苯胺可以作为鉴定可以作为鉴定DNA的试剂的试剂。 二、方法与过程二、方法与过程 1.1.制鸡血细胞液（活鸡鲜血经分离或沉淀获得）制鸡血细胞液（活鸡鲜血经分离或沉淀获得）0.1g/mL柠檬酸钠柠檬酸钠100mL活鸡鲜血活鸡鲜血180mL500mL烧杯中，玻棒烧杯中，玻棒搅拌搅拌，离心、分离或静置沉淀。离心、分离或静置沉淀。2.提取提取DNA。取血细胞取血细胞5-10mL20mL蒸馏水蒸馏水，用玻棒沿一个方向，用玻棒沿一个方向快速搅拌快速搅拌。纱布纱布过滤过滤：滤液中含：滤液中含DNA和其他核物质，如蛋白质。和其他核物质，如蛋白质。原理：血细胞的细胞膜、核摸吸水胀破，玻璃棒原理：血细胞的细胞膜、核摸吸水胀破，玻璃棒快速快速搅拌搅拌，机械加速血细胞破裂。，机械加速血细胞破裂。 滤液滤液2mol/L的的NaCl溶液溶液40mL，玻棒沿一个方向，玻棒沿一个方向轻缓搅拌，轻缓搅拌，溶解溶解DNA 。 在上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并沿一个方向在上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并沿一个方向轻轻轻搅拌轻搅拌，出现丝状物；，出现丝状物；当丝状物不再增加时当丝状物不再增加时，停止加，停止加水（此时水（此时NaCl溶液的浓度相当于溶液的浓度相当于0.14mol/L）。）。 用多层用多层纱布纱布过滤过滤，含，含DNA的粘稠物留在纱布上。的粘稠物留在纱布上。 20mL2mol/L的的NaCl溶液溶液步骤步骤含含DNA的粘稠物的粘稠物在20mL烧杯中烧杯中轻缓搅拌轻缓搅拌3min，使尽可能多的，使尽可能多的DNA溶解在溶解在NaCl溶液溶液。 用放有两层纱布的漏斗用放有两层纱布的漏斗过滤过滤步骤步骤所得的溶液，所得的溶液，滤液中含有滤液中含有DNA。 步骤步骤所得的滤液体积分数为所得的滤液体积分数为95%的冷却酒精的冷却酒精50mL，用玻棒沿一个方向，用玻棒沿一个方向轻缓搅拌轻缓搅拌，溶液中（，溶液中（析出析出）出现乳白色丝状物，用玻棒将丝状物卷起，并用滤纸出现乳白色丝状物，用玻棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。吸取上面的水分。3.DNA的鉴定：的鉴定： 加入二苯胺试剂加入二苯胺试剂4mL，用玻棒，用玻棒搅拌搅拌使使DNA溶解，溶解，沸水浴沸水浴5min，观察溶液是否出现浅蓝色。，观察溶液是否出现浅蓝色。1.共有共有“三次过滤，两次析出，七次搅拌三次过滤，两次析出，七次搅拌”2.加入加入“两次蒸馏水，两次蒸馏水，三次三次NaCl溶液，一次酒精，一次酒精”三、实验小结三、实验小结四、实验原理拓展介绍。四、实验原理拓展介绍。1.DNA的释放。的释放。 DNA主要在鸡血细胞的细胞核内，正常情况下不会主要在鸡血细胞的细胞核内，正常情况下不会释放出来，蒸馏水对于鸡血细胞是一种低渗液，水分可释放出来，蒸馏水对于鸡血细胞是一种低渗液，水分可以大量进入血细胞，使之胀破，同时加上玻璃棒快速搅以大量进入血细胞，使之胀破，同时加上玻璃棒快速搅拌的机械作用，加速血细胞的细胞膜和核膜的破裂。但拌的机械作用，加速血细胞的细胞膜和核膜的破裂。但释放出来的大量释放出来的大量DNA与与RNA、蛋白质结合在一起，即释、蛋白质结合在一起，即释放的不是纯净的放的不是纯净的DNA，常称为，常称为DNA核蛋白核蛋白。2.DNA与蛋白质分离。与蛋白质分离。 在高浓度（在高浓度（2mol/L）的氯化钠溶液中，核蛋白易溶）的氯化钠溶液中，核蛋白易溶解，析出解，析出DNA并溶解在高浓度的氯化钠溶液中并溶解在高浓度的氯化钠溶液中3.DNA的析出与获取。的析出与获取。 因为因为DNA在低浓度（在低浓度（ 0.14mol/L ）的氯化钠溶液中）的氯化钠溶液中溶解度小，而蛋白质的在其中的溶解度大溶解度小，而蛋白质的在其中的溶解度大。所以在向含。所以在向含DNA的高浓度的氯化钠溶液中加入大量蒸馏水稀释氯化的高浓度的氯化钠溶液中加入大量蒸馏水稀释氯化钠溶液，从而使钠溶液，从而使DNA溶解度下降，蛋白质溶解度增高。溶解度下降，蛋白质溶解度增高。4.DNA的再溶解。的再溶解。用高浓度（用高浓度（2mol/L）的氯化钠溶液再溶解）的氯化钠溶液再溶解DNA粘稠物。粘稠物。5.DNA的沉淀和浓缩。的沉淀和浓缩。 对于除去了蛋白质的对于除去了蛋白质的DNADNA的氯化钠溶液，必须再进的氯化钠溶液，必须再进一步沉淀和浓缩，常用一步沉淀和浓缩，常用酒精沉淀法酒精沉淀法。即往。即往含有含有NaNa的的DNADNA溶液，加入体积分数为溶液，加入体积分数为95%95%的冷却酒精，混匀后可的冷却酒精，混匀后可以使以使DNADNA沉淀、浓缩，形成含杂质较少的沉淀、浓缩，形成含杂质较少的DNADNA丝状物丝状物，悬浮于溶液中。若丝状物较少，可将混合液再放入冰悬浮于溶液中。若丝状物较少，可将混合液再放入冰箱中冷却几分钟即可。浓缩后的箱中冷却几分钟即可。浓缩后的DNADNA丝状物可以用玻棒丝状物可以用玻棒（玻棒有吸附（玻棒有吸附DNADNA的作用）缓缓旋转的方法卷起。的作用）缓缓旋转的方法卷起。6.DNA的鉴定。的鉴定。100DNA二苯胺二苯胺 蓝色物蓝色物鉴定时蓝色的深浅与溶液中鉴定时蓝色的深浅与溶液中DNA的含量多少有关。的含量多少有关。方法步骤方法步骤 加入物质加入物质 目的目的 1.制备鸡血细胞液 柠檬酸钠溶液 2.提取鸡血细胞细胞核物质 20 m1蒸馏水 3.溶解细胞核内的DNA 2 m1L 的NaCI溶液40mL 4.析出含DNA的黏稠物 蒸馏水 5.滤取含DNA的黏稠物 6.将DNA的黏稠物再溶解 2 molL 的NaCl溶液20 mL 7.过滤含DNA的NaCl 溶液 8.提取含有杂质较少的 DNA 冷却的95的酒精50 mL A:(1)向试管中加入0.015 molL 的NaCl溶液5mL (2)加入DNA (3)4 mL二苯胺试剂 9.DNA的鉴定 B:(1)向试管中加入0.015molL 的NaCl溶液5mL (2)4 mL 二苯胺试剂 加入柠檬酸钠溶液的目的是防止血凝固加入柠檬酸钠溶液的目的是防止血凝固加速血细胞破裂加速血细胞破裂 溶解溶解DNA 使使2mol/L的的NaCl溶液稀释至溶液稀释至0.14mol/L使得使得DNA最大限度地释出最大限度地释出 使含使含DNA的黏稠物被留在纱布上的黏稠物被留在纱布上使含使含DNA的黏稠物尽可能多的溶解于溶液中的黏稠物尽可能多的溶解于溶液中除去含除去含DNA的滤液中的杂质的滤液中的杂质提取纯化提取纯化DNA（与蛋白质分离）（与蛋白质分离） A出现蓝色出现蓝色 B无变化无变化2.实验中实验中NaCl的物质的量浓度为的物质的量浓度为2 molL和和0.14 molL对对DNA有何影响有何影响?1.在在DNA的粗提取实验过程中，两次向烧杯的粗提取实验过程中，两次向烧杯中加入蒸馏水的作用是中加入蒸馏水的作用是( )。A.稀释血液、冲洗样品稀释血液、冲洗样品B.使血细胞破裂、降低使血细胞破裂、降低NaCl浓度使浓度使DNA析出析出C.使血细胞破裂、增大使血细胞破裂、增大DNA溶解量溶解量 D.使血细胞破裂、提取含杂质较少的使血细胞破裂、提取含杂质较少的DNA答：答：B答：前者是溶解答：前者是溶解DNA，后者是使，后者是使DNA析出析出3.DNA3.DNA遇二苯胺遇二苯胺( (沸水浴沸水浴) )会染成会染成( ) ( ) A. A.砖红色砖红色 B.B.橘黄色橘黄色 C.C.紫色紫色 D.D.蓝色蓝色4.提取鸡血中的提取鸡血中的DNA时，为什么要除去血液时，为什么要除去血液中的上清液中的上清液?答：答：DNA的提取，关键是对杂质的去除，由于的提取，关键是对杂质的去除，由于上清液是血液中的血浆部分，不含上清液是血液中的血浆部分，不含DNA，所以，所以要除去上清液要除去上清液(含有蛋白质含有蛋白质)。答：答：D
