FlowJo软件的简单介绍和基本应用.pdf

FlowJoFlowJo 软件的简单介绍和基本应用软件的简单介绍和基本应用FlowJo 是九十年代美国斯坦福大学Leonard Herzenberg（FACS机器的发明者）实验室研发的一款流式数据分析软件。这款分析软件功能强大，操作简单，易学易用，可在Windows 或者 Mac 系统下安装使用。它简单直观的操作平台，已被领域内的科学家、实验室广泛使用。同时，他也是各期刊杂志引用最多的流式数据分析软件。一、一、FlowJoFlowJo 电脑配置及安装环境电脑配置及安装环境PC:操作系统：Vista、Windows7内存：512MB RAM 及以上MAC:操作系统：OSX 10.3 或更高版本内存：512MB RAM 及以上安装环境：避免阳光直射，水平放置，远离水源、热源二、二、FlowJoFlowJo 基本功能介绍基本功能介绍1.阶梯式设门：将细胞群之间的逻辑关系用简单、递进的阶梯式去呈现，一改传统复杂的逻辑门设置。并可以自定义细胞群名称，进而直观的显示细胞群统计值，让分析结果一目了然。如图2.多种图像显示方法及显示类型：显示方法：它可以呈现为一维的直方图，二维图及三维立体图。如图一维图二维图三维图显示类型:除了传统使用的散点图外，还有密度图，等高图，伪色图，斑马图等。如图13.多种设门工具：设门是流式数据分析中界定细胞目标群的必要手段，不管检测的目标细胞群是规则分布还是不规则分布的，是小概率事件还是集体事件，都可以很方便的界定各种细胞群。如图蜘蛛门四分门矩形门、椭圆门、自动门4.多种分析平台及工具：特殊的分析平台：细胞周期，细胞增殖，钙离子流量，反向设门等。独特的分析工具：门的批处理，样品的荧光补偿。5.灵活方便的数据导出：无论是图形数据还是表格数据都可以用 Ofice 软件、Powerpoint 或直接打印，输出的表格数据可保存为 HTML，SQL 等格式。三、三、FlowJoFlowJo 的基本应用：的基本应用：1.单标样本的分析方法：双击桌面 Flowjo 软件图标，进入软件工作台。软件工作台由菜单栏、工具栏、组空间和样本空间组成（见图 1） 。将要分析的数据组拖至组空间中， 单击选中分析组（3 color comp） ，此时在样本空间里便会显示分析组里的所有样本。然后双击样本空间中的样品（Cy5PE.fcs） ，出现图形窗口（以二维点图的形式，见图二） 。图一图二X 轴选择 SSC（侧向散射） ，Y 轴选择 FSC（前向散射） ，然后选择设门工具（矩形门、椭圆门、多边形门、自动门）中任一种。如图三，用椭圆门选中要分析的细胞群。在图形窗口中双击选中的细胞群，生成新的图形窗口。在 X 轴选择 CD4，Y 轴选择 Histogram ，选择设门工具（区域门、双分门）中任意一个，在单参数直方图中设门。双分门设门如图四，左边2区域为 CD4 阴性细胞，右边为 CD4 阳性细胞（见图五） 。图三图四图五2.图形的输出和保存：a.在单参数图上点击鼠标右键选择复制图片，可以吧图片粘贴到Word、Excel、PPT 中。b.在图形分析窗口菜单栏中选择“文件”并单击，选择下拉菜单中的“另存为”，选择保存位置、命名文件名称以及文件保存类型。c.在 Flowjo 工作台单击打开布局编辑器， 在样本空间中把 CD4 细胞的节点拖入布局编辑器中， 在布局编辑器中点击保存按钮， 在弹出的对话框中选择保存的路径， 名称及图片格式。如图六、七所示：图形布局编辑图六图七3.多色样本的分析方法：打开分析软件，将要分析的数据拖至工作台。在样本空间中双击要分析的样本，出现图形窗口，显示为二维点图。X 轴选择 FSC，Y 轴选择 SSC。然后选择多边形设门工具，在点图中选中要分析的细胞群(如图八)，双击门出现图形窗口，X 轴选择 CD3，Y 轴选择 FSC。使用矩形门选中 CD3 阳性细胞群，并命名为T 细胞。双击T 细胞门，出现图形窗口，在X 轴选择3CD4， Y 轴选择 CD8， 使用十字门设门 （如图九） ， 其中 Q1 区域为:CD8+， Q2 区域为: CD8+/ CD4+，Q3 区域为: CD4+，Q4 区域为：CD8-/ CD4-，见图十。图八图九图十4.双指数转换：如下图，图中所设的门范围很小，但却显示里面的细胞比例高达35.1%，这说明有很多细胞压在了坐标轴上。这时可以在X 轴和 Y 轴点击坐标轴边上的T 按钮，在弹出的下拉列表中选择“用双指数转换” ，如图十一、十二所示：图十一图十二注注：双指数转换只是更改了数据呈现的方式，不会对数据本身做任何更改。5.批处理功能：a.样品的批处理： 将一组数据重的标准品 Sample 1 分析完成后，按住 ALT 键，在工作台中单击样品 Sample 1 下的节点，将其拖到组空间的Titration Data 组上,这样就对该组中的所有样本都进行了与 Sample 1 样本中一样的设门和数据的统计。如图十三、十四：4图十三图十四b.图片的批处理：打开工作台常用工具栏中的布局编辑器将工作台中，将工作台中Sample 1 样本下的分析节点拖入布局编辑器， 点击布局编辑器右上角的批处理按钮 “Batch” ，如下图，便能得到图片的批处理结果。图十五图十六四、四、注意事项：注意事项：1.二维点图的设门原则二维点图常用四分门来设门，四分门设门要根据阴性对照界定阴性区。根据细胞分群的趋势，四分门的界定线可设置阴性、阳性细胞的分群处。2.多色标记分析说明多色样本分析在实验室中具有重要的地位， 只要把多色的分析简化为单标记和双标记的分析，问题就会迎刃而解。例如：检测 treg 需要标记 CD4/CD25/FOXP3，可以用 SSC vs CD4 的二维点图，把 CD4+的细胞圈出来。然后用CD25 vs FOXP3的二维点图，把 CD25+/ FOXP3+的细胞表示出来。这样就可以把 CD4+/CD25+/FOXP3+的 treg 细胞辨别出来。上面的实例（多色样本分析方法）就是把三标的样本转化为两个二维点图进行分析的。5