山东省地方标准：鸭新型呼肠孤病毒病诊断技术规范（定稿）.doc

ICS 11.220B 41DB37山东省 地方标准DB 37/T XXXXXXXXX鸭新型呼肠孤病毒病诊断技术规范Diagnostic techniques for novel duck reovirus diseaseXXXX - XX - XX 发布XXXX - XX - XX 实施山东省市场监督管理局 发 布DB37/T XXXXXXXXXI前 言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院家禽研究所。 本标准主要起草人：于可响、宋敏训、李玉峰、马秀丽、刘存霞、姜亦飞、胡峰、亓丽红、黄兵、 郭效珍、刘玉山。DB37/T XXXXXXXXX1鸭新型呼肠孤病毒病诊断技术规范1 范围本标准规定了鸭新型呼肠孤病毒病的临床诊断、实验室诊断和综合判定技术规范。 本标准适用于鸭新型呼肠孤病毒病的诊断和流行病学调查。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 鸭新型呼肠孤病毒病 又称“肉鸭脾坏死症”、“番鸭出血性坏死性肝炎”，是由鸭新型呼肠孤病毒引起的多品种雏鸭 脾脏出血和坏死为主要特征的疾病。该病毒在血清学和基因序列上与原有的番鸭呼肠孤病毒有明显差 异。4 临床诊断4.1 流行病学该病一年四季均可发生，不同品种的鸭均可发病，如樱桃谷鸭、麻鸭、番鸭、半番鸭等；发病日 龄一般为525日龄，其中以510日龄居多，病程57天。4.2 临床症状病鸭精神沉郁，发育不良，部分拉白色稀粪，一般不会出现神经症状，容易继发鸭疫里默氏杆菌、 大肠杆菌等细菌感染。发病率5 %35 %，死亡率20 %以下。4.3 病理变化脾脏表面出血或坏死是其主要病变特征。4.4 结果判定DB37/T XXXXXXXXX2符合4.1流行病学特征，病鸭出现4.2临床症状和4.3病理变化，可判为鸭新型呼肠孤病毒病疑似病 例，应进行实验室确诊。5 实验室诊断除非另有规定，实验室诊断所用化学试剂均为分析纯；试验用水符合GB/T 6682二级水的规定；实 验室生物安全要求按照GB 19489执行。5.1 病原分离鉴定5.1.1 仪器和设备5.1.1.1 高速冷冻离心机。 5.1.1.2 恒温培养箱。5.1.2 试剂或材料5.1.2.1 青链霉素（青霉素 10 000 IU/mL，链霉素 10 000 µg/mL）。 5.1.2.2 0.22 µm 微孔滤器。 5.1.2.3 8 日龄9 日龄鸭新型呼肠孤病毒抗体阴性鸭胚。5.1.3 病料处理按NY/T 541要求无菌采集发病鸭的脾脏1 g2 g，加入10倍体积生理盐水和终浓度2 000 IU/mL的 青链霉素，剪碎后充分研磨，反复冻融2次3次，8 000×g离心20 min，取上清液用0.22 µm微孔滤器 过滤，经菌检无菌后用于病原分离。5.1.4 操作步骤5.1.4.1 取 5.1.3 中处理好的上清液经尿囊腔接种 8 日龄9 日龄鸭新型呼肠孤病毒抗体阴性鸭胚， 0.1 mL/枚，共 5 枚。封口后置于 37 恒温箱继续孵化，每日照胚两次，记录鸭胚死亡情况，观察到 第 6 天。 5.1.4.2 弃掉接种后 24 h 内死亡的鸭胚，若接种 6 天内鸭胚出现死亡，则收集死亡鸭胚的尿囊液， 用 5.2、5.3、5.4 中的任意一种方法进行鉴定；若接种 6 天内鸭胚不出现死亡，则收集 6 天活胚的尿 囊液，用 5.2、5.3、5.4 中的任意一种方法进行鉴定。5.1.5 结果判定5.1.5.1 阳性：接种后死亡鸭胚或接种后 6 天活胚的尿囊液用 5.2、5.3、5.4 中的任意一种方法检测 为阳性。 5.1.5.2 阴性：接种后死亡鸭胚或接种后 6 天活胚的尿囊液用 5.2、5.3、5.4 中的任意一种方法检测 为阴性。5.2 RT-PCR 方法5.2.1 仪器和设备5.2.1.1 高速冷冻离心机。 5.2.1.2 PCR 扩增仪。 5.2.1.3 电泳仪。DB37/T XXXXXXXXX35.2.1.4 紫外分析仪。5.2.2 试剂或材料5.2.2.1 TRIZol。 5.2.2.2 无 RNA 酶水。 5.2.2.3 反转录酶 M-MLV。 5.2.2.4 RNA 酶抑制剂。 5.2.2.5 Taq 酶。 5.2.2.6 琼脂糖。 5.2.2.7 Goldview DNA 染料。 5.2.2.8 阳性参照物（鸭新型呼肠孤病毒）。 5.2.2.9 阴性参照物（阴性尿囊液）。5.2.3 操作步骤5.2.3.1 样品处理按NY/T 541要求无菌采集发病鸭的脾脏1 g2 g，加入10倍体积生理盐水，用剪刀剪碎后，置于 研磨器中充分研磨，反复冻融2次3次，8 000×g离心10 min，取上清液100 L用于RNA提取。5.2.3.2 RNA 提取5.2.3.2.1 在 100 µL 病料上清液中加入 1 mL TRIZol，剧烈颠倒 50 次100 次，室温静置 10 min 后， 加入 200 µL 氯仿，上下颠倒 50 次100 次，室温静置 5 min10 min，12 000×g 离心 10 min。 5.2.3.2.2 吸取上清加入等体积氯仿，上下颠倒 50 次100 次，12 000×g 离心 10 min。 5.2.3.2.3 吸取上清加入等体积的异丙醇，轻轻混匀后，-20 静置至少 30 min，然后 12 000×g 离心 15 min20 min。 5.2.3.2.4 弃上清液，加入 1 mL 75 %酒精，12 000×g 离心 5 min10 min。 5.2.3.2.5 弃上清液，倒置自然晾干，或 12 000×g 再离心 5 min，吸掉管底部的液体。 5.2.3.2.6 沉淀用 20 µL 无 RNA 酶水溶解，备用。阳性和阴性参照物 RNA 的提取同上。样品 RNA 提取 也可使用同等效果的商品化试剂盒。5.2.3.3 引物上游引物P1：5' TCATTCATTTGGGCAGCGG 3' 下游引物P2：5' AGTAGTGTGTAAAGCATGGACT 3'5.2.3.4 RT-PCR 扩增5.2.3.4.1 反转录（RT）反应反应体系为10 µL。在PCR管中加入dNTP(10 mmol/L) 0.8 µL，引物P1(20 µmol/L) 0.5 µL，引物 P2(20 µmol/L) 0.5 µL，RNA 5.0 µL，放PCR仪中70 作用5 min，然后取出冰浴1 min2 min，再加 入RNA酶抑制剂(40 U/µL) 0.5 µL，反转录酶M-MLV(200 U/µL) 0.7 µL，5×M-MLV buffer 2 µL，继续 放PCR仪中42 30 min，95 2 min。5.2.3.4.2 PCR 扩增5.2.3.4.2.1 反应体系DB37/T XXXXXXXXX4反应体系为50 µL，配制见表1。表 1 PCR 反应体系配制反应体系中各成分每个样品反应组分用量/µL10×PCR buffer4.520 µmol/L 引物 P10.520 µmol/L 引物 P20.5RT 产物5.05 U/µL Taq E0.5ddH2O39.0总体积50.05.2.3.4.2.2 反应程序采用以下反应程序进行扩增： 第一阶段：95 3 min； 第二阶段：95 20 s，55 20s，72 30 s，共进行 30 个循环； 第三阶段：72 10 min。 RT-PCR扩增也可使用商品化的RT-PCR试剂盒，按说明书要求操作。5.2.3.5 电泳取PCR扩增产物6 µL与10×上样缓冲液1 µL混合，加入到1.5 %的琼脂糖凝胶孔中，同时在旁边点 样孔中加入2 000 bp Ladder Marker（分子量标准物）10 µL，以5 V/cm电压进行电泳25 min30 min，在紫外分析仪上观察结果。5.2.4 结果判定5.2.4.1 试验成立条件在阳性对照出现一条大小226 bp的单一条带，同时阴性对照无此条带的情况下，检测结果成立。5.2.4.2 结果判定被检样品出现与阳性对照同样大小的条带时，判为阳性；被检样品未出现与阳性对照同样大小的 条带时，判为阴性。参见附录A。5.3 荧光 RT-PCR 方法5.3.1 仪器与设备5.3.1.1 高速冷冻离心机。 5.3.1.2 荧光定量 PCR 扩增仪。5.3.2 试剂或材料5.3.2.1 TRIZol。 5.3.2.2 无 RNA 酶水。 5.3.2.3 SYBR Green 荧光 RT-PCR 反应液（2×SYBR Premix）。DB37/T XXXXXXXXX55.3.2.4 阳性参照物（鸭新型呼肠孤病毒）。 5.3.2.5 阴性参照物（阴性尿囊液）。5.3.3 操作步骤5.3.3.1 样品处理参见5.2.3.1。5.3.3.2 RNA 提取参见5.2.3.2。5.3.3.3 引物上游引物P3：5' ATCGCACTATTGACGCACTT 3' 下游引物P4：5' TTGACGACGCCAATCCC 3'5.3.3.4 荧光 RT-PCR 扩增5.3.3.4.1 反转录（RT）反应 参见5.2.3.4.1。5.3.3.4.2 荧光 PCR5.3.3.4.2.1 反应体系反应体系为25.0 µL，配制见表2。表 2 荧光 PCR 反应体系配制反应体系中各成分每个样品反应组分用量/µL2×SYBR Premix12.520 µmol/L 引物 P30.520 µmol/L 引物 P40.5RT 产物1.0ddH2O10.5总体积25.05.3.3.4.2.2 反应程序采用以下反应程序进行扩增： 第一阶段：95 45 s； 第二阶段：95 10 s，56 10 s，72 15 s，40 个循环，每次循环在 72 延伸时收 集荧光。 荧光RT-PCR扩增也可使用商品化的Real-time RT-PCR试剂盒，按说明书操作。 反应结束后根据分析软件得出的Ct值和扩增曲线来判定结果。5.3.4 结果判定5.3.4.1 试验成立条件DB37/T XXXXXXXXX6在阳性对照的Ct值33且出现典型扩增曲线，阴性对照Ct值35的情况下，试验成立。5.3.4.2 结果判定当被检样品Ct值33且出现典型扩增曲线时，判为阳性；当被检样品无Ct值或者Ct值35时，判 为阴性；当被检样品Ct值在33-35之间时判为可疑，需重做，再次检测结果的Ct值35，且出现典型扩 增曲线，则判为阳性，否则判为阴性。参见附录B。5.4 RT-LAMP 方法5.4.1 仪器与设备5.4.1.1 高速冷冻离心机。 5.4.1.2 水浴锅。 5.4.1.3 紫外分析仪。5.4.2 试剂或材料5.4.2.1 TRIZol。 5.4.2.2 无 RNA 酶水。 5.4.2.3 甜菜碱（betaine）。 5.4.2.4 TritonX-100。 5.4.2.5 反转录酶 AMV。 5.4.2.6 RNA 酶抑制剂。 5.4.2.7 Bst DNA 聚合酶。 5.4.2.8 SYBR Green染料。 5.4.2.9 阳性参照物（鸭新型呼肠孤病毒）。 5.4.2.10 阴性参照物（阴性尿囊液）。5.4.3 操作步骤5.4.3.1 样品处理参见5.2.3.1。5.4.3.2 RNA 提取参见5.2.3.2。5.4.3.3 引物RT-LAMP检测引物序列见表3。表 3 RT-LAMP 引物序列引物名称序列（5-3 ）NDR-F3TGAGATATATTAGGGTGGGTCNDR-B3GACATGCCTAGTATGGAGCATNDR-FIPagcgatatcctgaggttgctTTTGCCATTGCTCTGCATGTCNDR-BIPaggcgaggatatgacgc TTTTCATCGATCATCTTCCAACCCDB37/T XXXXXXXXX75.4.3.4 RT-LAMP 扩增5.4.3.4.1 反应体系反应体系为25.0 µL，配制见表4。表 4 RT-LAMP 反应体系配制PCR 反应体系中各成分每个样品反应组分用量/µL10×Bst buffer2.510 mmol/L dNTP1.025 mmol/L MgCl23.05 mol/L Betaine2.010 µmol/L 外引物 NDR-F30.510 µmol/L 外引物 NDR-B30.540 µmol/L 内引物 NDR-FIP1.040 µmol/L 内引物 NDR-BIP1.040 U/L RNA 酶抑制剂1.05 U/L 反转录酶 AMV1.08 U/L Bst DNA 聚合酶1.0RNA5.0无 RNA 酶水5.5总体积25.05.4.3.4.2 反应程序采用以下反应程序进行扩增： 第一阶段：63 45 min； 第二阶段：85 2 min。5.4.4 结果判定5.4.4.1 试验成立条件反应结束后，取1 L 10倍稀释的SYBR Green加入产物中，混匀后在紫外线下观察。在阳性对 照出现黄绿色荧光，同时阴性对照不出现黄绿色荧光的情况下，试验成立。5.4.4.2 结果判定在紫外线下被检样品出现黄绿色荧光，判为阳性；在紫外线下被检样品未出现黄绿色荧光，判为 阴性。参见附录C。6 综合判定符合临床诊断规定的疑似病例经5.2、5.3、5.4中的任一方法检测，结果为阳性者，可判定为鸭新 型呼肠孤病毒病。DB37/T XXXXXXXXX8A A附 录 A （资料性附录） RT-PCR 结果电泳图RT-PCR结果电泳图见图A.1。说明：MDNA Marker DL2000；1阳性对照；2临床样品1；3临床样品2；4阴性对照。图 A.1 RT-PCR 结果电泳图DB37/T XXXXXXXXX9B B附 录 B （资料性附录） 典型扩增曲线示意图典型扩增曲线示意图见图B.1。说明：1阳性对照；2临床样品1；3临床样品2；4阴性对照。图 B.1 典型扩增曲线示意图DB37/T XXXXXXXXX10C C附 录 C （资料性附录） RT-LAMP 结果示意图RT-LAMP结果示意图见图C.1。说明：1阳性对照；2临床样品1；3临床样品2；4阴性对照。图 C.1 RT-LAMP 结果示意图_