化学发光免疫分析技术资料ppt课件.ppt

化学发光免疫分析技术化学发光免疫分析技术齐振普齐振普2014.10.通许通许发光免疫分析发光免疫分析: :是将发光分析和免疫反是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种新的检测应相结合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。技术。 放射免疫技术放射免疫技术酶免疫技术酶免疫技术发光免疫技术发光免疫技术三大经典标记技术三大经典标记技术 发光发光: :是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子的过程。到基态，并释放光子的过程。根据形成激发态分子的能量来源不同可分为根据形成激发态分子的能量来源不同可分为: :光照发光、生物发光、光照发光、生物发光、化学发光化学发光等。等。 光照发光光照发光（photoluminescence）是指发光是指发光剂（荧光素）经短波长的入射光照射后，电子剂（荧光素）经短波长的入射光照射后，电子吸收能量跃迁到激发态，在其回复至基态时，吸收能量跃迁到激发态，在其回复至基态时，发射出较长波长的可见光（荧光）。发射出较长波长的可见光（荧光）。 生物发光生物发光（bioluminescence）是指发生在生物是指发生在生物体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底物为体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底物为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利用萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利用ATPATP能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复基态时能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复基态时多余的能量以光子的形式释放出来。多余的能量以光子的形式释放出来。 化学发光化学发光（chemiluminescence）是指伴随化学反是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质应过程所产生的光的发射现象。某些物质( (发光剂发光剂) )在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。一、化学发光一、化学发光 一些化学反应能释放足够一些化学反应能释放足够的能量把参加反应的物质激的能量把参加反应的物质激发到能发射光的电子激发态，发到能发射光的电子激发态，若被激发的是一个反应产物若被激发的是一个反应产物分子，则这种反应过程叫直分子，则这种反应过程叫直接化学发光。反应过程可简单地描述如下：接化学发光。反应过程可简单地描述如下： A A十十B CB C* * C C* * C C h h其中其中为光子，为光子，C C* *表示表示C C处于单线激发态。处于单线激发态。 若激发能传递到另一个未参加化学反应若激发能传递到另一个未参加化学反应的分子的分子D D上，使上，使D D分子激发到电子激发态，分子激发到电子激发态，D D分子从激发态回到基态时发光，这种过分子从激发态回到基态时发光，这种过程叫间接化学发光。反应过程可表示如下：程叫间接化学发光。反应过程可表示如下： A A十十B CB C* * C C* *十十D CD C十十D D* * D D* * D D十十h h 化学发光效率决定于生成激发态产物分子的化化学发光效率决定于生成激发态产物分子的化学激发效率（学激发效率（CE）和激发态分子的发射效率）和激发态分子的发射效率（EM）。）。化学发光反应的发光效率、光辐射的化学发光反应的发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围，完全由发光物质的性质能量大小以及光谱范围，完全由发光物质的性质所决定，每一个发光反应都具有其特征性的化学所决定，每一个发光反应都具有其特征性的化学发光光谱和不同的化学发光效率。发光光谱和不同的化学发光效率。二、化学发光效率二、化学发光效率化学发光剂和标记技术化学发光剂和标记技术 在化学发光反应中参与能量转移并最终在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，称为以发射光子的形式释放能量的化合物，称为化学发光剂或发光底物。化学发光剂或发光底物。 一、化学发光剂一、化学发光剂能作为化学发光剂的条件：能作为化学发光剂的条件：发光的量子产率高；发光的量子产率高；它的物理它的物理- -化学特性要与被标记或测定的化学特性要与被标记或测定的 物质相匹配；物质相匹配；能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物；能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物； 其化学发光常是氧化反应的结果；其化学发光常是氧化反应的结果；在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。 直接化学发光剂直接化学发光剂 直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。接标记抗原或抗体。 1.1. 吖啶酯吖啶酯 在碱性条件下被在碱性条件下被H H2 2O O2 2氧化氧化时时, ,发出波长为发出波长为470nm470nm的光，具有很高的发的光，具有很高的发光效率，其激发态产物光效率，其激发态产物N-N-甲基吖啶酮是甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。该发光反应体系的发光体。 2 2三联吡啶钌三联吡啶钌 三联吡啶钌三联吡啶钌 RU(bpy)3RU(bpy)32+2+是是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPATPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。反应。 三联吡啶钌三联吡啶钌电化学发光剂反应原理电化学发光剂反应原理 酶促反应发光剂：酶促反应发光剂： 是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底 物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂 称为酶促反应发光剂。称为酶促反应发光剂。 1鲁米诺及其衍生物鲁米诺及其衍生物 2AMPPD1 1鲁米诺鲁米诺鲁米诺发光原理鲁米诺发光原理鲁米诺增强发光反应原理鲁米诺增强发光反应原理 2AMPPD3-(2-3-(2-螺旋金刚烷螺旋金刚烷)-4-)-4-甲氧基甲氧基-4-(3“-4-(3“-磷酰氧基磷酰氧基) )苯苯-1,2-1,2-二氧杂环丁烷二氧杂环丁烷1. 1. 碳二亚胺（碳二亚胺（EDCEDC）缩合法）缩合法 二、发光剂的标记技术二、发光剂的标记技术2. 2. 过碘酸钠氧化法过碘酸钠氧化法 3 3重氮盐偶联法重氮盐偶联法 4. N-4. N-羟基琥珀酰亚胺活化法羟基琥珀酰亚胺活化法 1 1发光剂的选择发光剂的选择 2 2被标记蛋白质的性质被标记蛋白质的性质 3 3标记方法的选择标记方法的选择 4 4原料比原料比 5 5标记率标记率 6 6温度温度 7 7纯化与保存纯化与保存 影响标记的因素影响标记的因素化学发光免疫分析的类型化学发光免疫分析的类型 用吖啶酯直接标记抗体用吖啶酯直接标记抗体( (抗原抗原) )，与待测标本中相应的抗，与待测标本中相应的抗原原( (抗体抗体) )发生免疫反应后，形成固相包被抗体发生免疫反应后，形成固相包被抗体- -待测抗原待测抗原- -吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H H2 2O O2 2）和）和NaOHNaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光发光 。 由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。标准曲线上计算出待测抗原的含量。一、直接化学发光免疫分析一、直接化学发光免疫分析发光发光Y Y Y YY Y磁微粒磁微粒被测抗原被测抗原+抗体抗体+带丫啶酯带丫啶酯标记物抗标记物抗体体Y YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY Y冲洗后冲洗后（1 1）加入加入H H2 2O O2 2（pH10）直接化学发光的机理直接化学发光的机理磁微粒磁微粒模式图模式图Y YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY Y特点特点抗原和抗体结抗原和抗体结合与未合与未结结合部分合部分的的易分离易分离磁微粒磁微粒技术技术 化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶）是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶或碱性磷酸酶(ALP)(ALP)来标记抗原或抗来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原体，在与待测标本中相应的抗原( (抗体抗体) )发生免疫反应后，形成发生免疫反应后，形成固相包被抗体固相包被抗体- -待测抗原待测抗原- -酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物底物( (发光剂发光剂) )，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。二、化学发光酶免疫分析二、化学发光酶免疫分析该分析系统采用辣根过氧化物酶（该分析系统采用辣根过氧化物酶（HRP）标）标记抗体记抗体(或抗原或抗原)，在与反应体系中的待测标，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体被抗体-待测抗原待测抗原-酶（酶（HRP）标记抗体复合）标记抗体复合物，这时加入鲁米诺发光剂、物，这时加入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发和化学发光增强剂使产生化学发光。光增强剂使产生化学发光。 辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图 该分析系统以碱性磷酸酶该分析系统以碱性磷酸酶 标记抗体标记抗体(或抗原或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原待测抗原-酶酶标记抗体复合物，这时加入标记抗体复合物，这时加入AMPPD发光剂，发光剂，碱性磷酸酶使碱性磷酸酶使AMPPD脱去磷酸根基团而发光。脱去磷酸根基团而发光。 碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图 分配样品分配样品,磁颗粒磁颗粒和试剂和试剂孵育孵育使反应物使反应物结合结合在磁场中在磁场中清洗去除清洗去除未结合物质未结合物质加入加入底物底物产生产生信号信号孵育孵育,促使信号促使信号的产生的产生信号信号检测检测电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析（electrochemiluminescence immunoassay， ECLIA）是以电化学发光剂三联吡啶钌标记是以电化学发光剂三联吡啶钌标记 抗体抗体( (抗原抗原) )，以三丙胺，以三丙胺(TPA)(TPA)为电子供体，为电子供体， 在电场中因电子转移而发生特异性化学发光在电场中因电子转移而发生特异性化学发光 反应，它包括电化学和化学发光两个过程。反应，它包括电化学和化学发光两个过程。 三、电化学发光免疫分析三、电化学发光免疫分析在电化学发光免疫分析系统中，磁性微粒为固相载体在电化学发光免疫分析系统中，磁性微粒为固相载体包被抗体包被抗体( (抗原抗原) )，用三联吡啶钌标记抗体，用三联吡啶钌标记抗体( (抗原抗原) )，在，在反应体系内待测标本与相应的抗原反应体系内待测标本与相应的抗原 ( (抗体抗体) )发生免疫发生免疫反应后，形成磁性微粒包被抗体反应后，形成磁性微粒包被抗体- -待测抗原待测抗原- -三联吡啶三联吡啶钌标记抗体复合物，这时将上述复合物吸入流动室，钌标记抗体复合物，这时将上述复合物吸入流动室，同时引人同时引人TPATPA缓冲液。当磁性微粒流经电极表面时，缓冲液。当磁性微粒流经电极表面时，被安装在电极下面的电磁铁吸引住，而未结合的标记被安装在电极下面的电磁铁吸引住，而未结合的标记抗体和抗体和标本标本被缓冲液冲走。与此同时电极加压，启动被缓冲液冲走。与此同时电极加压，启动电化学发光反应，使三联吡啶钌和电化学发光反应，使三联吡啶钌和TPATPA在电极表面进在电极表面进行电子转移，产生电化学发光，光的强度与待测抗原行电子转移，产生电化学发光，光的强度与待测抗原的浓度成正比。的浓度成正比。电化学发光免疫分析示意图电化学发光免疫分析示意图电化学发光免疫测定示意图电化学发光免疫测定示意图标记磁颗粒在电场中发光工作示意图标记磁颗粒在电场中发光工作示意图 1. 1.甲状腺激素甲状腺激素 2 2生殖激素生殖激素 3 3垂体激素和皮质激素垂体激素和皮质激素 4 4贫血因子贫血因子 5 5肿瘤标志物肿瘤标志物 6 6感染性疾病感染性疾病 7 7糖尿病糖尿病 胰岛素、血清胰岛素、血清C-C-肽、血浆胰高糖素等。肽、血浆胰高糖素等。 8 8心脏标志物心脏标志物 9 9病毒标记物病毒标记物 1010过敏性疾病过敏性疾病 1111治疗药物监测治疗药物监测 四、临床应用四、临床应用 发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态跃迁到激发态，然后再返回到基态，并释基态跃迁到激发态，然后再返回到基态，并释放光子的过程。化学发光是吸收了化学反应过放光子的过程。化学发光是吸收了化学反应过程中所产生的化学能使分子激发而发光。化学程中所产生的化学能使分子激发而发光。化学发光免疫分析是将化学发光与免疫反应相结合，发光免疫分析是将化学发光与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的标记免疫分析技术，用于检测微量抗原或抗体的标记免疫分析技术，分为直接化学发光免疫分析，化学发光酶免疫分为直接化学发光免疫分析，化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析。分析和电化学发光免疫分析。小小 结结免疫化学发光的种类及主要不同点免疫化学发光的种类及主要不同点名称名称免疫荧光免疫荧光化学发光化学发光电化学发光电化学发光简写简写FATCLIAECLIA原理原理发光剂经短波长的发光剂经短波长的光照射后，由光照射后，由基态（低能级）基态（低能级）跃迁到激发态跃迁到激发态（高能级），（高能级），然后再返回到然后再返回到基态，并释放基态，并释放出光子。出光子。 发光剂在化学发光剂在化学反应过程中，反应过程中，吸收了化学吸收了化学能被激发，能被激发，电子跃迁到电子跃迁到激发态，再激发态，再返回到基态返回到基态并发光。并发光。以三联吡啶钌标记以三联吡啶钌标记抗体（抗原），抗体（抗原），以三丙胺（以三丙胺（TPA）为电子供体，在为电子供体，在电场中因电子转电场中因电子转移而发生特异性移而发生特异性电化学发光反应。电化学发光反应。名称名称免疫荧光免疫荧光化学发光化学发光电化学发电化学发光光发光底发光底物物荧光素，罗丹明，铕（Eu3+）,4-甲基伞形酮1.直接化学发光（丫啶酯，三联吡啶钌）2.酶促化学发光（鲁米诺，金刚烷（AMPPD）三联吡啶钌名称名称免疫荧光免疫荧光化学发光化学发光电化学发光电化学发光检测检测方式方式1.荧光抗体技术（固相荧光免疫分析）2.免疫荧光检测（时间分辨荧光免疫测定，荧光偏振免疫测定，荧光酶免疫测定）1.直接化学发光（固相抗体+待测抗原+丫啶酯标记抗体+H2O2 + NaOH 发光），光信号强度反映待测物浓度2.酶免疫发光(CLEIA)固相抗体+待测抗原+辣根过氧化酶标记抗体+鲁米诺+H2O2 +发光增强剂发光，固相抗体+待测抗原+碱性磷酸酶标记抗体+AMPPD发光，光信号强度反映待测物浓度磁性微粒标记抗体+待测抗原+三联吡啶钌标记抗体复合物流动池三丙胺（TPA）在电极表面发生电子转移发光，光强度与待测抗原成正比名称名称免疫荧光免疫荧光化学发光化学发光电化学发光电化学发光检测仪器检测仪器荧光显微镜免疫荧光检测仪化学发光分析仪电化学发光分析仪名称名称免疫荧光免疫荧光化学发光化学发光电化学发光电化学发光临床应临床应用用1.病理组织、细胞（淋巴细胞表面的CD抗原等），自身抗体（抗核抗体，抗平滑肌抗体，抗线粒体抗体等）2.激素，肿瘤标志物等1.激素（甲状腺激素，性激素，胰岛素，C-肽，HCG等）2.肿瘤标志物（AFP，CEA，PSA，CA-199，CA-125，CA-153，CA72-4等）3.感染（衣原体抗体，支原体抗体，弓形虫抗体，风疹病毒抗体，巨细胞病毒抗体等）4.病毒标志物定量（乙肝，丙肝抗体，抗-HIV等）5.治疗药物检测（地高辛，茶碱，巴比妥等）名称名称免疫荧光免疫荧光化学发光化学发光电化学发光电化学发光特点特点1.荧光抗体技术可以检测荧光抗体技术可以检测组织、细胞的抗体等。组织、细胞的抗体等。2.荧光酶免疫测定由于使荧光酶免疫测定由于使用酶和荧光底物作为放用酶和荧光底物作为放大系统，灵敏度大大提大系统，灵敏度大大提高。高。3.时间分辨荧光免疫时间分辨荧光免疫测定灵敏度高，检出量测定灵敏度高，检出量可达可达10-18mol/L(普通荧光普通荧光免疫技术只能达到免疫技术只能达到10-8mol/L)；分析范围；分析范围宽，达宽，达4 45个数量级；个数量级；标记结合物稳定，有效标记结合物稳定，有效期长；无放射污染等。期长；无放射污染等。1.化学放光酶免疫分化学放光酶免疫分析属酶免疫测定范析属酶免疫测定范畴，测定过程与畴，测定过程与ELISA相似，仅最后相似，仅最后一步酶反应的底物改一步酶反应的底物改为发光剂和测定的仪为发光剂和测定的仪器为光信号检测仪；器为光信号检测仪；2.梅标记抗原或抗体梅标记抗原或抗体结合稳定；结合稳定；3.酶催化鲁米诺、酶催化鲁米诺、AMPPD等发光剂发等发光剂发出的光稳定，持续时出的光稳定，持续时间长，便于记录和测间长，便于记录和测定。定。三联吡啶钌在电三联吡啶钌在电场中因不断得到三场中因不断得到三丙胺提供的电子，丙胺提供的电子，可周而复始地发可周而复始地发光，持续时间长，光，持续时间长，信号强度高，容易信号强度高，容易测定，容易控制；测定，容易控制；三联吡啶钌直接三联吡啶钌直接标记抗原或抗体，标记抗原或抗体，结合稳定，不影响结合稳定，不影响标志物的理化特标志物的理化特性；性；试剂灵敏度试剂灵敏度高，稳定性好。高，稳定性好。