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发酵发酵fermentation 根据微生物的种类不同，可分为好氧性发酵、厌氧性发酵和兼性发酵。 （1）好氧性发酵(aerobic fermentation)：在发酵过程中需要通入一定量的无菌空气，满足微生物呼吸需要。 e.g. Bacillus subtilis -amylase Corynebacterium 265-inosinic acid Asp.niger Uv06-citric acid C.glutamicum As1299-glutamic acid在好氧发酵条件在好氧发酵条件丙酮酸进入丙酮酸进入TCA环，进行代谢，产生各种好环，进行代谢，产生各种好氧代谢产物或完全氧化获得能量。氧代谢产物或完全氧化获得能量。B、 三羧酸循环 三羧酸循环一定需要氧才能进行。在三羧酸循环中脱下的氢，形成NADH 和 FADH2，然后再逐步传递给氧。丙酮酸三个二氧化碳三个二氧化碳三羧酸循环淀粉葡萄糖丙酮酸CO2+H2OATP生物体内氧化分步骤进行第一节第一节 酒精发酵机制酒精发酵机制1酵母菌的酒精发酵 第四章第四章 厌氧发酵机制厌氧发酵机制 1.1 酒精生成机制(1 ) 葡萄糖（glucose） EMP 丙酮酸（pyruvic acid） 己糖磷酸化作用 EMP 六碳糖转变为三碳糖磷酸丙糖 丙酮酸 (2) 丙酮酸乙醇 丙酮酸（pyruvic acid ）丙酮酸脱羧酶乙醛（acetaldehyde） 乙醛 乙醇脱氢酶 乙醇 （alcohol） 由葡萄糖生成乙醇的总反应式为 C6H12O6 + 2ADP +2H3PO4 2CH3CH2OH + 2CO2 + 2ATP则1mol葡萄糖生成2mol乙醇，理论转化率为 246.05/180.1100%=51.1% 但是在生产中大约有5%的葡萄糖用于合成酵母细胞和副产物，实际上乙醇生成量约为理论值的95%，则乙醇对糖的实际转化率约为48.5%。 酵母菌在无氧的条件下，通过以上12步反应，1分子G生成分子的乙醇，分子的CO2和 2分子ATP。整个过程可用下面的简图表示。 2CH3COCOOH 4ATP Mg2+ 2ATP 2CO2 2CH3CHO NADH+H+ NAD+ C6H12O6 2C2H5OH 1、从乙醇，无氧气参与，是无氧呼吸过程。 2、有脱氢反应，脱下的氢由辅酶携带。还原型NADH+H+通过与乙醛反应而重新被氧化的。 3、从乙醇，净得ATP 。 4、发酵过程的某些反应需辅酶和辅助因子。 1.2 酒精发酵中副产物的形成酒精发酵中副产物的形成 主产物（product） ：乙醇（alcohol） 副产物（by product ）： 二氧化碳（carbon dioxide） 甘油（glycerol） 乙醛（acetaldehyde） 瑚珀酸（ succinic acid ） 乙酸（acetic acid） 酯（ester） 高级醇（higher alcohol） 双乙酰（diacetyl）1.2.1 杂醇油的生成 杂醇油是碳原子数大于2的脂肪族醇类的统称，主要由正丙醇、异丁醇、 异戊醇和活性戊醇组成，这些高级醇是构成酒类风味的重要组成成分之一，当其过量时会影响产品质量，是酒类产品中质量指标之一，应予以控制。1.2.1.1酒精发酵中高级醇的形成途径 a.氨基酸氧化脱氨作用 试验证明转氨基是在-酮戊二酸间进行, 根据此机制，由缬氨酸产生异丁醇，异亮氨酸产生活性戊醇，酪氨酸产生酪醇，苯丙氨酸产生苯乙醇等。 b由葡萄糖直接生成1.2.1.2 影响杂醇油形成的条件a.菌种。在同样的条件下，不同菌种的杂醇油生成量相差很大。酵母的杂醇油生成量与醇脱氢酶活性关系密切，该酶活力高，杂醇油生成量大。b.培养基组成。培养基中支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸）的存在，可增加相应的高级醇（异戊醇、活性戊醇和异丁醇 ）的生成量。培养基中氮水平高，形成杂醇油量少，杂醇油总形成量因氮水平高而降低。c.发酵条件。一般发酵温度高，高级醇生成量高，通风有利于高级醇生成。高级醇的生成与乙醇的生成是平行的，随乙醇的生成而生成。1.2.2双乙酰（diacetyl）1.2.2.1双乙酰合成途径 双乙酰是啤酒生产过程中的重要成分，它是酵母细胞内生物合成缬氨酸亮氨酸的中间产物；也是衡量啤酒成熟和质量水平的主要指标它赋予啤酒一种不愉快的馊味，淡色贮藏啤哂的双乙酰含量应控制在0.1mg/L以下。 双乙酰是-乙酰乳酸在酵母细胞外非酶氧化的产物，是酵母在生长繁殖时，在酵母细胞体内用可发酵性糖经-乙酰乳酸合成它所需的缬氨酸、亮氨酸途径中的副产物，中间产物-乙酰乳酸部分排出酵母细胞体外，经氧化脱羧作用生成双乙酰。CH3CHO-TPP(活性乙醛)CH3COCOOH -乙酰乳酸乙酰乳酸 缬氨酸缬氨酸双乙酰双乙酰2,3-丁二醇非酶氧化酵母还原+双乙酰合成消除途径1.2.2.2 双乙酰的消除双乙酰的消除措施措施:.提高麦汁中氨基氮的含量；提高麦汁中缬氮酸的含量 通过反馈作用，抑制从丙酮酸合成缬氨酸的支路代谢作用。.利用酵母的还原作用，将双乙酰转变成2,3-丁二醇；.利用二氧化碳的洗涤作用，排除双乙酰。4. 加入-乙酰乳酸脱羧酶;5.使用基因工程构建的含有-乙酰乳酸脱羧酶的酵母菌株 酯是啤酒香味的工要组成成分，它是通过酯酰辅酶A与醇缩合而形成的。 传统淡色啤酒以酒花香为主体香，含有适量的酯，才使啤酒香味丰满协调。过高的酯含量会使啤洒有不愉快的香味。近代啤酒中的酯含量与高级醇一样，普遍有升高的趋势。有的酒其乙酸乙酯大于阈值，有淡雅的果实香味，也成为一种独特的风味。 啤酒的香味 果酒的香味酒花香麦芽香发酵过程形成的各种酯类的香味果香发酵香陈酿香形成途径：通式：R-CO-SCOA +ROH RCOOR +COA-SHR-CO-SCOA脂肪酸的激活作用酮酸的氧化作用 在ATP的作用下，使脂肪酸活化 酮酸的氧化作用R-COOH + ATP + COA-SH RCOSCOA + AMP + PPi RCOCOOH + NAD +COASH RCO-SCOA + NADH2 + CO2 影响影响酯含量酯含量因素因素:a.酵母菌种，不同的酵母菌种，发酵时形成的酯量是不同的；b.发酵温度高，有利于酯类的形成；c.接种量大，酯类的形成量低。2. 细菌的酒精发酵细菌的酒精发酵（alcoholic fermentation of bacteria) 菌种为运动发酵单孢菌（Zymomonas Mobilis），少数假单胞杆菌（Pseudomonas），如林氏假单胞菌（Ps.lindneri）能利用G经经ED途径进行酒精发酵。总反应式为 C6H12O6+ADP+H3PO4 2C2H5OH+2CO2+ATP产物和酵母菌的酒精发酵相同，但产能水平各异。 ED途径途径(脱氧酮糖酸途径脱氧酮糖酸途径)由部分EMP途径、部分HMP途径组成 ED途径的途径的 三个阶段三个阶段 1、G 氧化分解氧化分解 6-磷酸葡萄糖酸磷酸葡萄糖酸 +NADPH（HMP） 2、6-磷酸葡萄糖酸磷酸葡萄糖酸 三碳糖三碳糖 6-P-葡萄糖酸脱水酶葡萄糖酸脱水酶 6-P-葡萄糖酸 2-酮-3-脱氧-6- P-葡萄糖酸 2-酮-3-脱氧-6- P-葡萄糖酸 丙酮酸+3-P-甘油醛 3、氧化产能阶段、氧化产能阶段 3-P-甘油醛 EMP 丙酮酸 总反应式 C6H12O6+NADP+ NAD+ ADP+ Pi 2CH3COCOOH+ NAD 2H+ NADP 2H +ATP 在ED途径中生成的2分子丙酮酸脱羧生成乙醛，乙醛还原生成乙醇。 在末端假单胞菌中能使2分子丙酮酸脱羧，然后还原乙醛生成2分子乙醇和2分子CO2；而在其他假单胞菌中氢载体再氧化后，生成1分子的乙醇、1分子乳酸和1分子CO2。 代谢速度快； 发酵周期短，比酵母菌的酒精产率高； 厌氧且耐高温； 能利用多种糖类 发酵工艺技术要求高优点：优点：缺点：缺点：第二节第二节 乳酸发酵机制乳酸发酵机制 一、 同型乳酸发酵同型乳酸发酵：进行乳酸发酵的主要是细菌。进行乳酸发酵的主要是细菌。 它们利用糖经糖酵解途径生成丙酮酸，丙酮酸还原产生乳酸。发酵产物中主要为乳酸的称为同型乳酸发酵同型乳酸发酵，如乳链球菌（Streptococcus lactics）、乳酪链球菌（ Streptococcus cremoris）、干酪乳杆菌（lactobacillus casei）、保加利亚乳杆菌（Lac. bulgaricus）等。 2H（乳酸脱氢酶） C6H12O6 EMP 2CH3COCOOH 2CH3CHOHCOOH 同型乳酸发酵的特点：1mol的的G产生产生2mol乳酸，乳酸，理论转化率是100%。另外有很少量的乙醇、乙酸和二氧化碳等。 二、二、 异型乳酸发酵异型乳酸发酵 发酵产物中除乳酸外同时还有比例较高的乙酸、乙醇、二氧化碳等，称为异型乳酸发酵异型乳酸发酵。其生物合成途径有两种。 1. 6-磷酸葡萄糖酸途径：磷酸葡萄糖酸途径： 葡萄糖经6-磷酸葡萄糖生成5-磷酸核酮糖，再经差向异构作用生成5-磷酸木酮糖；后者经磷酸解酮酶催化，分解为3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸。乙酰磷酸经磷酸转乙酰酶作用变为乙酰CoA，再经乙醛脱氢酶作用生成乙醇。而3-磷酸甘油醛经EMP途径生成丙酮酸。后者经乳酸脱氢酶催化还原为乳酸。如下图所示。 通过该途径，1mol的G产生1mol的乳酸，乳酸对糖的理论转化率是50%。另外有比例较高的乙醇、乙酸和二氧化碳等。 肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）及葡聚糖明串珠菌（Leuconostoc dextranicum）通过该途径进行异型乳酸发酵。2. Bifidus 途径（双歧途径）：途径（双歧途径）： 双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum)进行的乳酸发酵也是一条磷酸解酮酶途径。该途径的特点是：有两个磷酸酮解酶参与；在没有氧化作用和脱氢作用下，2分子G分解为3分子乙酸和2分子3-磷酸甘油醛。接着，在3-磷酸甘油醛脱氢酶和乳酸脱氢酶的参与下， 3-磷酸甘油醛转化为乳酸，转化率为50%。 微生物的代谢途径一般都不是单一的，因此，不论同型乳酸发酵还是异型乳酸发酵，实际代谢产物都不象代谢途径中那样单纯，所以，两类乳酸发酵的代谢产物没有不可逾越的界限。在微生物的分类研究中，通常把发酵1mol葡萄糖产生的乳酸少于1.8mol，同时还产生较多的乙醇、CO2或乙酸、甘油、甘露醇等产物的乳酸菌称为异型乳酸菌。同型乳酸菌发酵的微生物已经用来发酵产生乳酸。异型乳酸发酵的微生物，例如双歧杆菌，已经用于发酵生产活菌饮料，并越来越受重视。第三节第三节 甘油合成机制甘油合成机制一、一、 亚硫酸盐法甘油发酵亚硫酸盐法甘油发酵 酵母菌在酒精发酵时，如加入亚硫酸氢钠等盐类，它能与乙醛起加成作用，生成难溶的结晶状亚硫酸纳加成物，这样就使乙醛不能作为受氢体，而迫使磷酸二羟丙酮作为受氢体，在- 磷酸甘油脱氢酶（NAD为辅酶）催化下生成- 磷酸甘油，后者在- 磷酸甘油磷酸酯酶催化下生成- 甘油。 CH2OH OH C6H12O6+NaHSO 3 CHOH +CH3- C -H OSO2Na+CO2 CH2 OH Q:为什么果酒中的甘油含量较高？为什么果酒中的甘油含量较高？ 1mol葡萄糖只产生1mol甘油，不产生ATP，整个过程无ATP积余，可见在甘油发酵过程中亚硫酸盐不能加得太多亚硫酸盐不能加得太多，否则会使酵母菌因得不到能量而终止发酵，必须留一部分酒精发酵，以使获得一些能量，供生命活动所需。 2ATP CO2 NaHSO 3 2ATP 3-磷酸甘油醛丙酮酸乙醛乙醛亚硫酸钠加成物葡萄糖1.6-二磷酸果糖 Pi 2H EMP 磷酸二羟丙酮 - 磷酸甘油甘油 该过程也称酵母菌的II型发酵。 Pi二二 碱法甘油发酵碱法甘油发酵 酒精酵母的发酵液在保持碱性（pH7.6以上）的条件下，乙醛不能作为正常的受氢体，乙醛在碱性溶液里分子乙醛之间发生歧化反应，相互氧化还原，生成等量的乙醇和乙酸。此时，由磷酸甘油醛脱氢生成的 NADH+H+用来还原磷酸二羟丙酮，并进而生成甘油 CH2OH 2C6H12O6+H2O 2CHOH +C2H5O H+CH3COOH+2CO2 CH2 OH 碱法甘油发酵的产品有甘油、乙醇、乙酸，也不产生ATP ，所以此法只能在酵母的非生长情况下进行发酵。 第四节第四节 沼气发酵机制沼气发酵机制 沼气（沼气（biogas） (甲烷，甲烷，methane) 甲烷发酵属于厌氧消化(anaerobic digestion)处理，是有机物厌氧分解过程中的主要过程。利用厌氧菌将工厂废水、下水污泥中所含有的有机物进行分解，不用对培养基进行灭菌和纯种培养和接种操作。它可以作为好氧处理的前阶段处理。甲烷气体（沼气）是生物燃气的主要成员。 一、一、 甲烷发酵机理甲烷发酵机理 甲烷发酵是厌氧菌厌氧菌将碳水化合物、脂肪、蛋白质等复杂的有机物最终分解成甲烷和CO2，甲烷发酵不是由单一的甲烷产生菌所能完成的，甲烷发酵至少由三个阶段组成： 第一个阶段是有机聚合物水解生成单体化合物，进而分第一个阶段是有机聚合物水解生成单体化合物，进而分解成各种脂肪酸、解成各种脂肪酸、CO2和和H2； 第二阶段是各类脂肪酸进行分解，生成乙酸第二阶段是各类脂肪酸进行分解，生成乙酸、 CO2和和H2； 第三个阶段是由乙酸和第三个阶段是由乙酸和CO2及及H2反应生成甲烷；反应生成甲烷； 前两个阶段也可统称为产酸阶段，产酸阶段也叫液化阶段，参与这一阶段反应的微生物大部分是兼性厌氧细菌，只有少数的原生动物、霉菌和酵母参与这一反应。发酵液中这一类非甲烷产生菌的数量大体上与甲烷产生菌相等。 复杂有机物复杂有机物 发酵细菌发酵细菌 可溶性简单有机物可溶性简单有机物 产酸菌产酸菌 挥发性脂肪酸挥发性脂肪酸 （丙酸，异丁酸，异戊酸）（丙酸，异丁酸，异戊酸） 专性质子还原菌专性质子还原菌 醋酸醋酸 H2+HCO3 纯醋酸菌纯醋酸菌C H4 甲烷菌甲烷菌 CH4 HCO3 H + HCO3 H2CO3 H2O+CO2 H2O复杂的有机物受到各类微生物复杂的有机物受到各类微生物(biogas producing bacteria)的作用，生成简单的可溶性有机物，可溶性有机的作用，生成简单的可溶性有机物，可溶性有机物经产酸菌的代谢生物经产酸菌的代谢生H2 、醋酸和其它脂肪酸（、醋酸和其它脂肪酸（35碳），碳），丙酸等丙酸等35个碳的脂肪酸，不能直接被甲烷菌转化生成甲个碳的脂肪酸，不能直接被甲烷菌转化生成甲烷，而先要有一种专性质子还原菌或醋酸菌将它们转化烷，而先要有一种专性质子还原菌或醋酸菌将它们转化为醋酸和氢。为醋酸和氢。甲烷菌将甲烷菌将H2 、HCO3 （生成碳酸盐）或醋酸转化为（生成碳酸盐）或醋酸转化为甲烷（甲烷（CH4），并产生），并产生ATP。生成碳酸盐在溶液中和碳酸相平衡，后者与溶解态的CO2 相平衡，液相CO2 又与气相CO2相平衡。最终的产物是生物气体（CH4+ CO2 ）。两者比例与基质、细菌分解途径、pH、和发酵液的缓冲能力有关，CH4占的比例为50%90%。 二、甲烷发酵的微生物二、甲烷发酵的微生物产酸阶段也叫液化阶段，参与的微生物大部分是兼性厌氧菌，只有少量的原生动物、霉菌和酵母参与这一反应。产酸阶段的细菌有产酸阶段的细菌有：梭菌属（Clostridium）；芽孢杆菌（Bacillus）；葡萄球菌属（Staphlococccus）；变形杆菌属（Froteis）；杆菌属(Bacterium)。甲烷产生阶段主要是甲烷产生菌参与甲烷产生阶段主要是甲烷产生菌参与。甲烷菌是严格厌氧菌，不产孢子。 采用新的厌气培养技术，可以分离得到20种以上的甲烷产生菌。 产甲烷杆菌（ Methanobacterium ）； 甲烷短杆菌（Methanobrevibacterium ）； 甲烷球菌（ Methanococci ）； 甲烷微球菌（ Methanomicrobium ）等细菌。各种甲烷菌之间在RNA排列顺序上都很相似，它们都是具它们都是具有嗜盐性，而且比典型的细菌耐温和耐酸。有嗜盐性，而且比典型的细菌耐温和耐酸。所以有人将甲烷菌和嗜盐菌、嗜热菌、嗜酸菌等一起分类属于古细菌古细菌。甲烷菌和非甲烷菌叫沼气菌（biogas producing bacteria）。发酵液中非甲烷产生菌的数量与甲烷产生菌相等，达106108个/ml。甲烷发酵的三个阶段是相互依赖和连续进行的，并保持动态平衡。如果平衡遭到破坏，沼气发酵就受到影响，甚至停止。 1)菌种培养： 取自然界正在进行甲烷发酵的河沟或沼泽底部的污泥或工厂废水加入甲烷发酵槽,保持适当温度,使细菌繁殖; 2)发酵温度：中温发酵37C38C；高温发酵53 C 54 C；在一种温度下长期持续培养，在另一种温度下就很难获得满意的效果，这是因为两类甲烷菌种类不同造成的。 高温发酵处理能力较低温发酵大2.5倍。 3)废水组成：废水中要有营养，除作为能源的碳源外，还有氮源。废水中的磷不足，可用化肥补充，甲烷发酵的最适p值为7，不适时，可进行中和； 4)污泥浓度：甲烷发酵中，持续进行的厌氧污泥将在液体中积累，含有甲烷细菌体、碳酸盐、氢氧化钠、硫化物、未分解的污泥残渣，污泥越多，越能促进甲烷发酵； 5)抑制物：有硫化物、硝酸盐、许多重金属、洗涤剂和醇类特别是不饱和醇，首先抑制甲烷菌，使气体减少，抑制物浓度再高，产酸菌也受到抑制。 Q ： 1、酵母的酒精发酵机制酵母的酒精发酵机制. 2、酵母的酒精发酵中酵母的酒精发酵中影响杂醇油形成的条件. 3、酵母的酒精发酵中、酵母的酒精发酵中双乙酰的消除双乙酰的消除措施措施. 6、甲烷发酵的过程分哪几个阶段？各起什么作用？甲烷发酵的、甲烷发酵的过程分哪几个阶段？各起什么作用？甲烷发酵的微生物是什么？甲烷发酵需考虑哪些因素？微生物是什么？甲烷发酵需考虑哪些因素？