SDS-PAGE测量蛋白质分子量解析.ppt

实验目的n学习聚丙烯酰胺凝胶聚合原理；n学习不连续聚丙烯酰胺凝胶分离原理；n掌握垂直板电泳的操作方法；n学习SDS-PAGE测蛋白分子量原理并测定。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE (Polyacryamide gel electrophoresis)支持介质聚丙烯酰胺凝胶聚合原理：单体丙烯酰胺Acr交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺Bis化学聚合光聚合引发剂（NH4)2S2O8 （NH4)2S2O8 核 黄 素 加速剂TEMEDDMAPNTEMED注：（NH4)2S2O8 过硫酸胺在凝胶形成中提供始自由基，通过自由基的传递，使丙烯酰胺 成为自由基，发动聚合反应 TEMEDN，N，N，N-四甲基乙二胺 DMAPN二甲基胺基丙晴 影响聚合因素大气中氧能淬灭自由基，使聚合反应终止，所以在聚合过程中要使反应液与空气隔绝。 某些材料如有机玻璃，能抑制聚合反应。某些化学药物可以减慢反应速度，如赤血盐。温度高聚合快，温度低聚合慢。碱性条件下凝胶易聚合，其聚合速度与AP浓度的平方根成正比。聚丙烯酰胺凝胶优点 化学性质稳定；凝胶孔径可调； 重复性好；分辨率高； 灵敏度高，可以测定10-6浓度的样品。凝胶浓度的计算n聚合后的聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔径大小均取决于两个重要参数T和C，T是丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺两个单体的总百分浓度。C是与T有关的交联百分浓度。T与C的计算公式是：n上式中a为丙烯酰胺的克数，b为甲叉双丙烯酰胺的克数，m为水或缓冲液体积（ml）。式中a与b的比例很重要。富有弹性，且完全透明的凝胶，a与b的重量比应在30左右。1001babC1001babC1001babC（）100babC(100mbaT(100mbaT(100mbaT(100mbaT(100mbaT(100mbaT(100mbaT(100mbaT(100mbaT(100mbaT(100mbaT(100mbaT(100mbaT）分子量范围与凝胶浓度的关系物 质分子量范围适用的凝胶浓度（%）蛋白质 510520-30 15-20 10-15 5-102-5核酸 104 104-105105-2106 10-20 5-102-2.55%10%15%294566972002945669720029456697200 5 7 9 11 13 15 T%A B凝胶浓度T对样品迁移率的影响例：混合蛋白质A,B，A分子量较小，B分子带电荷较多，T5时，电泳行为主要以电荷起作用，B 迁移速度快。当 T 增加，分子筛效应增加，B的迁移速度减慢；T 9 时，A，B的迁移率相同，不能分开，T 再增加，凝胶孔径更小，A分子比B分子小，表现较高的迁移率。并且说明电泳只获得单一的带时，并不能证明是单一的均一成分。迁移率 不连续凝胶电泳（不连续凝胶电泳（discdisc）的分离原理）的分离原理(一).原理n不连续凝胶电泳系统具有与一般电泳的 电荷效应电荷效应分离外，还具有浓缩效应浓缩效应与分子筛效应分子筛效应，因而，能提高电泳的分辨率；使电荷性质与密度相近的但分子量有差别的分子得以分离；或分子量相近、性质一样、电荷性质与密度有差别的分子可以分离；或电荷性质、分子量大小相近，但构型不同时亦可分离。n不连续凝胶电泳洗脱 碱性不连续分离酸性样品 酸性不连续分离碱性样品 大多数蛋白质分子呈酸性或中性，适合用碱性系统进行电泳分离。浓缩效应 1.凝胶的组成：浓缩胶为大孔径（稀） T5，分离胶一般为小孔径（浓）T7.5。样品在较稀的凝胶上自由迁移，直至浓凝胶时，便形成一道栅栏，所有的样品分子在浓缩胶的界面堆积成一窄带，得到浓缩，然后，再依据分子量的大小进行电泳分离。 2.缓冲液的组成:图示。PH系统的不连续，各种分子的电荷之间的差异进行分离。 3.缓冲体系的不连续，其中各组成的离子、快慢离子迁移快慢的差别是影响样品浓缩效应的重要因素。 4.离子的迁移速率及浓度的不连续又造成电场强度与电导率的变化。分子筛效应分子筛效应n移动界面到达浓缩胶和分离胶界面时，凝胶的PH变化明显，缓冲液中甘氨酸的解离迅速增加，直至完全解离出 gly-,其分子量小，迁移超过蛋白质分子。而丧失夹击的作用；同时，凝胶的孔径变小，降低了蛋白质的迁移率。故蛋白质分子在均一的电压梯度和PH 值中泳动，依其分子量的大小而分开。电荷效应电荷效应操作操作垂直柱状，板状的不连垂直柱状，板状的不连续凝胶电泳系统的组成续凝胶电泳系统的组成和配制；和配制；均一凝胶与梯度凝胶配均一凝胶与梯度凝胶配制；制；电极缓冲液系统；电极缓冲液系统；样品的准备；样品的准备；加样要求加样要求电泳电泳检测检测PH8.3PH6.7PH8.9PH8.3n 垂直柱状，板状垂直柱状，板状的不连续凝胶电泳的不连续凝胶电泳系统的组成和配制系统的组成和配制缓冲液系统n浓缩凝胶缓冲液0.5mol/L Tris-HCl,PH6.8n分离凝胶缓冲液1.5mol/L Tris-HCl,PH8.8电极缓冲液系统 0.025mol/L Tris（三羟甲基氨基甲烷） 0.2mol/Gly (甘氨酸) PH8.3n样品缓冲液 0.1mol/L Tris-HCl,PH 6.8, 40%甘油、0.05mg/ml溴酚蓝n样品缓冲液的要求： 选择合适的PH与离子强度，以保证样品的溶解性、稳定性、生物活性。并加入便于观察电泳前沿的指示剂。标准蛋白质样品n标准蛋白质样品：是一组（57种）已知的合适的分子量范围的、构形相近的一套蛋白质，溶解在样品缓冲液中备用。样品的浓度n分析目的、检测方法和样品的组成是关键；未知样品浓度：0.120mg/ml考玛斯亮篮染色：12mg/ml银 染 色 :0.020.2mg/ml 高纯度样品： 0.52mg/ml加样电泳 光吸收检测 考玛斯亮篮染色 染色 银 染 色 SDS-PAGE测蛋白质分子量 SDS-PAGE是在PAG系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。影响结合的因素主要有三个：溶液中SDS单体的浓度。当单体浓度大于1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1:1.4，如果单体浓度降到0.5 mmol/L以下时，两者的结合比仅为1: 0.4。这样就不能消除蛋白质原有的电荷差别；为保证蛋白质与SDS的充分结合，它们的重量比应该为1:4或1:3；样品缓冲液的离子强度。SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低，通常是10100mmol/L；1)二硫键是否完全被还原。n采用SDS-PAGE测蛋白质MW时，只有完全打开二硫键，蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系。因此在用SDS处理样品同时常用巯基乙醇处理，巯基乙醇是强还原剂，可使被还原的二硫键不易再氧化，从而使很多不溶性蛋白质溶解而与SDS定量结合。n有许多蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇作用下，解离成亚基或单条肽链，因此这一类蛋白质，测定时只是它们的亚基或单条肽链的MW。n已发现有些蛋白质不能用SDS-PAGE测定分子量。如电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（某些糖蛋白）以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。n一般至少采用两种方法测定未知样品的分子量，互相验证。 实验试剂和器材 1.材料： 低分子量标准蛋白试剂盒: 低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200 兔肌动蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 根据说明书处理标准蛋白 样品：称3mg样品，加2 ml蒸馏水溶解。2.实验试剂 (1) 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺 （Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中， 4贮存可用1-2月。（2）10%SDS（十二烷基硫酸钠）（3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl分离胶缓冲液：称取 Tris18.2g加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.9， 最 后用蒸馏水定容至100ml。（4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl浓缩胶缓冲液：称取 Tris12.1g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8， 最后用蒸馏水定容至100ml。（5）0.05mol/LpH6.8Tris-HCl样品溶解缓冲液：称取 Tris0.6g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8，最 后用蒸馏水容至100ml。（7）10%过硫酸铵(AP)（8）TEMED（四甲基乙二胺）（9）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝（2mg）+甘油（2g） +0.05mol/L pH8.3Tris- HCl（2ml），最后定容至10ml。（10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。（11）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液 250ml， 过滤后备用。（12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml。（13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘 氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。2.实验试剂实验步骤1.装板： 将垂直板型电泳装置内的板状凝胶模子取出，将玻璃片洗净、凉干、嵌入凹槽中，形成一个“夹心”凝胶腔，把装好的凝胶腔置于仰放的电极上槽。将电泳槽、凝胶模子串成一体的垂直板型电泳装置，垂直放置在水平台面上，灌注胶液。凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝 结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。水封的目的是为了使分离胶上延平直，并隔绝空气。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。 分离胶分离胶( (10% 15ml10% 15ml) )浓缩胶浓缩胶(5% 5ml)(5% 5ml)ddHddH2 2O O5.4ml5.4ml3.2ml3.2ml30%Acr30%Acr5.0ml5.0ml0.85ml0.85mlBufferBuffer1.5mol/L pH=8.8 1.5mol/L pH=8.8 Tris-HCl 3.8mlTris-HCl 3.8ml0.5mol/L pH=6.8 0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 0.65mlTris-HCl 0.65ml10%SDS10%SDS150l150l50l50l10%Ap10%Ap150l150l50l50lTEMEDTEMED500l500l200l200l 配 胶 3.样品及MW标准参照物溶液的制备 样品溶液和上样缓冲液混匀，使用前在100水浴1min，以除去可能出现的亚稳态聚合物。4.上样。 15l/孔5.电泳 上槽接负极，下槽接正极，打开电泳仪开关，开始时将电流调至10mA，待样品进入分离胶时，将电流调至20-30mA。待指示剂染料靠迁移至下沿11.5cm处停止电泳，需23h。6.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，将凝胶放入0.05%考马斯亮蓝R250（内含20磺基水杨酸）染色液中，使染色液没过胶板，染色30min左右。7.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，用7乙酸浸泡漂洗数次，直至背景蓝色褪去蛋白质区带清晰为止。如用50水浴或脱色摇床，则可缩短脱色时间。 *剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分8.MW的计算 以标准蛋白质MW的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线，根据待测样品相对迁移率，从标准曲线上查出其MW 。= 蛋白样品距加样端迁移距离cm溴酚蓝区带中心距加样端距离cm 相对迁移率注意事项n丙烯酰胺具有中等毒性。常人每天允许的最大暴露量不超过0.5g/kg，皮肤接触可致中毒，症状为红斑、脱皮、眩晕、动作机能失调、四肢无力等。n丙烯酰胺是神经毒剂，可以透过皮肤，不要接触皮肤，戴手套、口罩操作。n一定要催化充分，使之完全聚合。没有聚合的丙烯酰胺不要倾倒到水源附近。n集中处理，实验中全部的胶由专门受过训练的人收集到一起，在一个特殊标明的容器中保存，并进一步催化使之反应完全，最后送交学校危险品仓库，统一处理。For example:Markers Proetins A B A+B 200 kD116 kD 66 kD 45 kD 31 kD21.5kD14.4kD 6.5kD12% Separating Gel思考题1. 简述聚丙烯酰胺凝胶聚合的原理，如何调节凝胶的孔径?2. 为什么样品会在浓缩胶中被压缩成层？3. 上样缓冲液中蔗糖及溴酚蓝各有何用途？4. 上下两槽电泳缓冲液电泳后，能否混合存放？为什么？常见问题及解决办法1 1.纹理和拖尾现象：由于样品溶解不好引起的，克服的方法可以在加样前离心，增加一些增溶辅助试剂如尿素； 2 2.蛋白带过宽，与邻近泳道的蛋白带相连是由于加样量太多，可以减少上样量；3 3.电泳时间比正常要长。可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高；4 4.指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向上的曲线形），说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好，导致分子有不同的迁移率所致； 5 5.指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向下的曲线形），由于电泳槽的装置不合适，尤其是凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片得凝胶聚和不完全； 6 6.凝胶时间不对。通常胶在30min-1H内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，AP剂量不够或者失效。AP应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。如果凝的太快，可能是AP和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂。