考马斯亮蓝法测蛋白质含量.doc
Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-date考马斯亮蓝法测蛋白质含量考马斯亮蓝法测蛋白质含量标准曲线制作考马斯亮蓝法测蛋白质含量一、 标准曲线一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。二、 蛋白质含量测定方法1、 凯氏定氮法2、 双缩脲法3、 Folin-酚试剂法4、 紫外吸收法5、 考马斯亮蓝法三、 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量标准曲线制作（一）、试剂：1、 考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。2、 标准蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。（二）、器材：1、722S型分光光度计使用及原理（）。2、移液管使用（）。（三）、标准曲线制作：试管编号0123456100ug/ml标准蛋白（ml）0.00.10.20.30.40.50.60.15mol/L NaCl （ml）10.90.80.70.60.50.4考马斯亮蓝试剂 （ml）5555555摇匀，1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色A595nm1、2、以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。1）、利用标准曲线查出回归方程。2）、用公式计算回归方程。3）、或用origin作图 ，测出回归线性方程。即A595nm=a×X( )+6一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。（四）、蛋白质含量的测定：样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。一般被测样品的A595nm值在0.10.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。（五）、注意事项：1、 玻璃仪器要洗涤干净。2、 取量要准确。3、 玻璃仪器要干燥，避免温度变化。4、 对照：用被测物质以外的物质作空白对照。药品的配制（磷酸缓冲液的配制）一、药品的配制步骤（一）、实验准备：1、 准备所需的药品和玻璃仪器。2、 洗涤。（怎样洗涤算干净？）（二）、计算：1、百分比浓度计算：1)、G/V比例如配1% NaCl，称1g NaCl溶于100ml 水。2）、V/V比：例如配75%乙醇100ml，75%×100%=100%×X, X=75ml。取75ml无水乙醇，加25ml蒸馏水。乙醇：乙醚：丙酮=2：1：2配500ml，各取200 ml，100 ml，200 ml混合。3）G/V比：用的较少，如计算灰分中某种元素如Fe的含量。2、摩尔浓度计算：注：药品的分子量一般在标签中注明。1）、0.1M或0.1mol/L NaCl配100ml。M=质量/体积（L）称取NaCl0.1×0.1×40=0.4g 摩尔数=G（g）/摩尔质量2）、0.1mMNaCl配100mlmM=毫摩尔数/体积（L） 称取NaCl0.1×0.1×40=0.4g 毫摩尔数=G（mg）/摩尔质量3）、0.1uNaCl配100mlmM=微摩尔数/体积（L） 称取NaCl0.1×0.1×40=0.4mg微摩尔数=G（ug）/摩尔质量 称取NaCl0.1×0.1×40=0.4ug 3、 混合溶液配制的计算：如配3uMEDTA，2.25mM NBT以及60uM 溶液100ml，用50mM磷酸缓冲液配制。注意：1、分别标定体积计算2、分别配制再混合，但总体积不能 为100ml（三）、标量：1、 根据需要选择不同量程的天平根据要求去不同精度的测量器，如量筒或移液管。2、 电子分析天平的使用。（四）、溶解：1、 根据药品配置要求选择溶剂。蒸馏水，双蒸水，无离子水等。2、 只能用烧杯溶解。注意加入溶剂只能加入总体积的2/3左右，剩余溶剂洗涤烧杯三次左右，直到洗涤干净。小常识：药品标签中一般标识有药品的溶解性能和分子式，可根据分子式和所学的常识判断药品的结构和性质特点（包括溶解性质）。如酸碱两性物质的配制（AA、蛋白质、核苷酸等）如果溶解性能不好可以用稀酸或稀碱促进溶解，但pH应在被要求的范围内。3、 加热促进溶解，但注意应在配制的范围内有的药品还需水溶加热较好。如:配0.1%的淀粉，水裕加热（温度在80-90。C），过量会糊化。（五）、定容：1、 用容量瓶定容；2、 用玻璃棒引流或用小漏斗；3、 用溶剂加入到接近刻度，然后用滴管加入到刻度。要求刻度与液体凹面相切为止（眼睛可视）；4、 上下窑洞容量瓶几次，混合均匀即可。(注意不再定容了，防止溶液漏掉。)（六）、装入试剂瓶，贴上标签。标签应注明以下内容：药品浓度、名称、配制人、配制日期等。（七）、清理实验场所。二、磷酸缓冲液的配制。（一）、配制0.2mol/L即0.2M pH=6.8的磷酸缓冲液。用磷酸氢二钠磷酸二氢钠做缓冲液。选用药品：Na2HPO4·12H2O（碱）和NaH2PO4·12H2O（酸）配缓冲液100ml。书中说明。（二）、计算 ：1、 注：书中有注明配置的量。2、 计算：Na2HPO4·12H2O称取71.64×0.1=7.164gNaH2PO4·12H2O称取 31.21×0.1=3.121g3、 含有不同结晶水的换算。书中配1/15mol/L的缓冲液配1L，书中用Na2HPO4·2H2O需要11.87g/L但用Na2HPO4·12H2O需多少g？11.87=（178/358）×X，X=23.87g。（三）、分别配制缓冲液各100ml（根据需要确定配制的量）。即：0.2M Na2HPO4·2H2O和NaH2PO4·2H2O100ml。（四）、按书中的量配制取量再混合。如：pH=6.8，分别去缓冲对49ml和51ml。（五）、用pH试纸ceni索赔的缓冲液的pH值，检测配置是否准确。（六）如配50mM pH =6.8的缓冲液100ml ，以你配制的母液稀释即可。计算：50×0.1=0.2×1000×X （L）；X =0.025L；取0.2M pH=7.2的缓冲液25ml，用蒸馏水定容至100ml即可。 -
