WB原理、步骤及总结.doc

Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-dateWB原理、步骤及总结WB原理、步骤及总结实验原理蛋白质印迹是把电泳分离的蛋白质转移到固定基质上，然后利用抗原抗体反应来检测特异性的蛋白分子的技术，包括三个部分：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳转移，免疫印迹分析。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质相对分子质量，SDS是阴离子去污剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏其高级结构。SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4:1，由于SDS带有大量的负电荷，与蛋白质结合时掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使各种蛋白质带有相同密度的负电荷，形似长椭圆棒，蛋白迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈线性关系。因此，利用相对分子质量标准蛋白所作的标准曲线，可以求得未知蛋白的相对分子质量。电泳后蛋白质分子嵌在凝胶介质中，探针分子很难通过凝胶孔，将蛋白质从凝胶转移到固定基质上可以对蛋白质进行免疫检测分析。方法有两种：水平半干式转移即将凝胶和固定基质似三明治样夹在缓冲液浸湿的滤纸中间，通电1030min可完成垂直湿式转移即将凝胶和固定基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电24h或过夜可完成。固定基质通常有硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜和尼龙膜。蛋白质转移到固定化膜上之后，通过蛋白质染料如丽春红S检测膜上的总蛋白，或用考马斯亮蓝检测凝胶上的蛋白剩余量，以验证转移是否成功。用抗体作为探针进行特异性的免疫反应检测抗原蛋白，分为4步：用非特异性、非反应活性分子封阻固定化膜上未吸附蛋白的自由结合区，以防止作为探针的抗体结合到膜上，出现检测时的高背景固定化膜用专一性的一抗温育，使一抗与膜上的抗原蛋白分子特异性结合酶标二抗与一抗特异结合加入酶底物，适当保温，膜上便可见到颜色反应，检测出抗原蛋白区带。主要溶液10%分离胶 水 3.3mL、30% 丙烯酰胺混合液 4.0mL、1.0mol/L Tris（pH8.8）2.5mL、10% SDS 0.1mL、10%过硫酸铵0.1mL、TEMED 0.004mL5%浓缩胶 水2.7mL、30%丙烯酰胺混合液0.67mL、1.0mol/L Tris0.5mL、10%SDS0.04Ml/10%过硫酸铵0.04mL、TEMED0.004mL1×Tris 甘氨酸电泳缓冲液 Tris碱3.03g、甘氨酸18.77g、SDS 1g，用去离子水定容至1L2×SDS凝胶加样缓冲液 Tris-HCl（pH6.8） 100mmol/L，-巯基乙醇10%，10%甘油，0.01%溴酚蓝，10%SDS转移缓冲液 Tris 2.45g，甘氨酸11.25g，甲醇100mL，加去离子水至1LTBST Tris 1.21g NaCl 8.77g，Tween-20 1 mL，加去离子水至1LStripping1.3mL Tris （pH 6.8），4mL10%SDS，140µl-巯基乙醇，用水定容到20mL实验步骤1 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶配置 分离胶的配置：将配置好的分离胶液混匀后迅速倒入胶槽中，至距离短玻璃板顶端约2cm处，停止灌胶。检查是否有气泡，若有用滤纸条吸出。然后在胶液界面上加蒸馏水进行水封。1530min后，凝胶和水封层界面清晰，说明胶已经聚合完全，然后用滤纸吸取水封层，滤纸切勿接触到凝胶面。（使蛋白样品分离） 浓缩胶的配置：将配置好的浓缩胶灌注在分离胶之上，直至短玻璃板的顶端，然后插入样品槽梳子。室温下浓缩胶聚合，约2030min。（使蛋白样品浓缩）蛋白样品的处理将蛋白样品溶于样品溶解液，终浓度为0.51mg/ml。然后转移到小离心管中，轻轻盖上盖子（不能塞紧，以免加热时液体迸出），在100沸水浴中加热3min，取出冷却后备用，使用前需要将样品离心除去颗粒物质。暂时用不到的话，可放在20冰箱长期保存，使用时沸水浴中加热3min，以除去亚稳聚合态物质。上样前的样品一定要均匀以防电泳时出现纵向条带。加样拔去样品槽梳子，倒入电极缓冲液，没过短板约0.5cm以上，若样品槽中有气泡，用枪头挑除。按顺序向凝胶样品槽中加入标准蛋白和未知蛋白样品，每孔的加样量要相同，一般加样体积为1030µl，加样时枪头深入到加样槽内，尽量接近底部，记录加样顺序。电泳上槽接负极，下槽接正极，打开直流稳压电源，先80V过了浓缩胶后改为120V，待溴酚蓝指示剂迁移到凝胶下沿1cm时停止电泳。2 蛋白质的电转移水平半干式电转移戴乳胶手套剪滤纸6张，滤纸长与宽比SDSPAGE胶各大1cm。裁剪与SDSPAGE胶长宽相等的NC膜。将3张滤纸和SDSPAGE胶浸在负极转移液中待用。将另3张滤纸和NC转移膜浸在正极转移液中待用。将浸在负极转移液中的滤纸取出，尽量少带液体，置于转移槽负极上，然后在负极滤纸上依次铺放SDSPAGE胶、NC膜、3张用正极转移液饱和的滤纸。注意排除气泡，因为气泡会产生高阻抗点，形成低效印迹区，即所谓“秃斑”。盖上石墨阳极板，设定50mA恒流，转移一定时间。垂直湿式转移凝胶片的平衡：把电泳后的凝胶从玻璃板上转移至成有适量转移缓冲液的大培养皿中，浸泡3060min,以除去胶中的SDS，使其pH及离子强度和印迹缓冲液相一致，防止凝胶发生膨胀或皱缩。将转移缓冲液冷却至4准备NC膜和滤纸：戴乳胶手套裁剪与凝胶大小相同的NC膜和4张滤纸，用转移缓冲液浸润膜和滤纸15min，直到没有气泡，将海绵在转移缓冲液中充分浸湿打开蛋白质转移槽的转移夹，依次放入：浸湿的海绵，两张用转移缓冲液饱和的滤纸，用转移缓冲液浸过的胶，NC膜，两张用转移缓冲液饱和的滤纸，浸湿的海绵，然后合上转移夹。转移槽中倒入转移缓冲液，然后将转移夹置于槽中，凝胶靠近负极NC膜靠近正极将转移槽放到4冰箱内，电转移，恒流80 mA，4 h。3 免疫印迹分析NC膜上总蛋白的染色和脱色：将电泳转移完后的NC膜取出，置于培养皿中。丽春红S染色3min后，用铅笔轻轻标出标准蛋白带的位置以备计算特异性蛋白质相对分子质量所需。然后，用丽春红S脱色液轻轻漂洗数次至红色消失。特异性抗体检测脱色后的NC膜置于培养皿中，加入封闭液，并在水平摇床上不断振摇，室温下封闭2h以上。（将膜上未结合目的蛋白的区域封闭以防止一抗的结合）倒出封闭液，加入漂洗液，水平摇床上不断振摇，洗膜3次，每次5min。（除去封闭液）漂洗完后，将膜转移至杂交袋中，加入特异性一抗，4摇床过夜或室温放摇3h（一抗与目的抗原蛋白特异性结合）利用水平摇床，用TBST洗膜3次，每次5min。（洗去未结合的一抗）将膜转移到稀释的酶标二抗中，在室温下孵育30min倾去二抗，用TBST洗膜，室温摇洗三次，每次5min，蛋白面朝上，置于保鲜膜中，将ECL的A液和B液以1:1体积混合，于暗室中，按0.05-0.1ml/2的量滴加于膜表面，孵育1min，滤纸吸去多余液体用保鲜膜包好，立即于暗室内曝光数秒。在暗室中，将 1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出 X光片，剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大 1cm）；打开 X-光片夹，把 X光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为 1min 或 5min，曝光完成后，打开X-光片夹，取出 X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为 12min（2025），温度过低时（低于 16）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把 X-光片浸入定影液中，定影时间一般为 510min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。注意事项在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性；不同浓度的凝胶用于分离不同相对分子质量的蛋白选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键、二硫键；对于多亚基蛋白或含多条肽链的蛋白，SDSPAGE只能测定它们的亚基或单条肽链的相对分子质量。尽量除去核酸、多糖、脂类等干扰分子；蛋白质样品在处理过程中应低温下进行，以避免细胞破碎释放出各种酶对其进行修饰尽量使用新鲜的loading buffer，样品要与loading buffer混合均匀，不可将蛋白质反复冻融使用以防改变蛋白质的抗原特性，Buffer一定要漫过梳子孔，否则可能会发现蛋白跑不动；电泳时先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，特别是对于高分子量的目的蛋白，硝酸纤维素（NC)膜：NC与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小； 非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便。但结合在NC上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失； NC韧性较差，易损坏。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜：与蛋白质亲和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。但价格上稍贵。为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小要先将膜晾干，然后浸入20%的甲醇，待完全浸湿后取出透光观察即可看到蛋白条带（适用于PVDF膜）。传统方法是将膜用1×丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇），然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。 高背景可能的原因：膜未均匀浸泡；膜或缓冲液污染；封闭不充分；抗体与封闭液出现交叉反应；抗体浓度过高。解决方法有：转膜前用100%甲醇将膜完全浸泡；杂交前检测一抗、二抗；检测一抗、二抗与封闭液是否有交叉反应。转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。 作用 定性分析蛋白质，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量，分析目的蛋白表达的特异性。蛋白样品的制备（1） 单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1、 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 2、 每瓶细胞加3ml 4预冷的PBS（0.01M pH7.27.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 3、 按1ml裂解液加10 l PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） 4、 每瓶细胞加400 l含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 5、 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） 6、 于4下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷） 7、 将离心后的上清分装转移到离心管中放于20保存。 （2） 组织中总蛋白的提取： 1、 将少量组织块置于12ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。 2、 加400 l单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。 3、 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。 4、 裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于20保存。 （3） 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取： 由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，除了按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。培养液中细胞总蛋白的提取： 1、 将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。 2、 弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。 3、 用枪洗干上清后，加100 l裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。 4、将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于20保存。 （三） 蛋白含量的测定（1） 制作标准曲线 1、 从20取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。 2、 取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0mg，2.5mg，5.0mg，10.0mg，20.0mg，40.0mg。 3、 按下表在各管中加入各种试剂。 0mg2.5mg5.0mg10.0mg20.0mg40.0mg1mg/ml BSA2.5ml5.0ml10.0ml20.0ml40.0ml0.15mol/L NaCl100ml97.5ml95.0ml90.0ml80.0ml60.0mlG250考马斯亮蓝溶液1ml1ml1ml1ml1ml1ml4、 混匀后，室温放置2min。在生物分光光度计上比色分析。 （2） 检测样品蛋白含量 1、 取若干1.5ml离心管，每管加入4储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min后即可用于测蛋白。 2、 取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液100 ml，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。 3、 弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml），再用无菌水洗一次。 4、 取一管考马斯亮蓝加95 ml0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5ml待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。 注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5 ml样品含的蛋白量。主要参考生物化学实验教程 刘箭 主编分子生物学实验指导 魏群 主编还有百度上搜的关于wb的方法步骤及试验中出现的问题热致相分离法的英文缩写TIPS，是Thermally Induced Phase Separation的简称.原理是在聚合物的熔点以上，将聚合物溶于高沸点，低挥发性的溶剂（又称稀释剂）中，形成均相溶液。然后降温冷却。在冷却过程中，体系会发生相分离。这个过程分两类，一类是固液相分离（简称S-L相分离），一类是液液相分离（L-L相分离）。控制适当的工艺条件，在分相之后，体系形成以聚合物为连续相，溶剂为分散相的两相结构。这时再选择适当的挥发性试剂（即萃取剂）把溶剂萃取出来，从而获得一定结构形状的聚合物微孔膜。与NIPS法相比，TIPS有许多优点：它通过较为迅速的热交换促使高分子溶液分相，而不是缓慢的溶剂一非溶剂交换；TIPS法避免了NIPS法（非溶剂致相分离法）由于存在溶剂一非溶剂交换，导致成膜液中部分溶剂参与了聚合物的凝胶化，所以孔隙率低的缺点；TIPS法可用于难以采用NIPS法制备的结晶性聚合物微孔滤膜的制备，而且TIPS法的影响因素要比NIPS法少，更容易控制；由TIPS法可获得多种微观结构，如开孔，闭孔，各同向性，各异向性，非对称等。 2 热致相分离制膜步骤 TIPS法制备微孔膜的步骤主要有溶液的制备（可连续也可间歇制备）、膜浇注和后处理3步。具体操作为：（1）聚合物与高沸点、低分子量的液态或固态稀释剂混合，在高温时形成均相溶液；（2）将混合物溶液制成所需要的形状（平板、中空纤维或管状）；（3）冷却溶液使其发生相分离；（4）除去稀释剂（常用溶剂萃取）；（5）除去萃取剂（蒸发）得到微孔结构。-