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Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-date中国海洋大学分子生物学-复习资料中国海洋大学分子生物学-复习资料第0章 绪论1. 分子生物学 广义层次：在分子水平上研究生命活动及其规律的科学。 狭义层次：生物学分支，研究生物大分子结构、功能、相互作用，从分子水平揭示生物遗传变异机制。2. 分子生物学的新学科：v 功能基因组学：依附于对DNA序列的了解，应用基因组学的知识和工具去了解影响发育和整个生物体的特征序列表达谱。v 蛋白质组学：以蛋白质组为研究对象，研究细胞内所有蛋白质及其动态变化规律的科学。v 生物信息学：对DNA和蛋白质序列资料中各种类型信息进行识别、存储、分析、模拟和传输。v 系统生物学：是在细胞、组织、器官和生物体整体水平研究结构和功能各异的各种分子及其相互作用，并通过计算生物学来定量描述和预测生物功能、表型和行为。v 结构分子生物学：是以分子生物物理学为基础，结合化学和分子生物学方法测定生物大分子复合体的空间结构、精细结构以及结构的运动，阐明其相互作用的规律和发挥生物功能的机制，从而揭示生命现象本质的科学 。核苷酸链第1章 遗传的物质基础主要内容：第一节 遗传物质的本质核酸 第二节 核酸的化学组成、结构特征与性质1. 证明核酸是遗传物质的经典实验：Griffith and Avery 肺炎链球菌转化实验Hershey and Chase T2噬菌体转导实验àDNA是遗传物质通过TK gene进行的真核细胞转染实验烟草花叶病毒病毒重建实验àRNA也是遗传物质转化(transformation)指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。转导(transduction)由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称转导。转染(transfection)指真核细胞主动或者被动导入外源DNA 片段而获得新表型的过程。2. 核酸基本单位是核苷酸Ø 每分子核苷酸包含一个碳、氮原子的杂环化合物（碱基）、一个环状五碳糖（戊糖）和一个磷酸分子基团。Ø 碱基分为嘌呤和嘧啶两种。Ø 戊糖分为2-脱氧核糖和核糖。3. 核苷酸的连接5-三磷酸核苷酸是核酸合成的前体。三磷酸的5末端与多聚核苷酸链末端的3-OH基团反应，释放三磷酸的两个末端磷酸基团（g和b），a磷酸与多聚核苷酸链末端的糖的3-OH成键。 4. 概念Ø Antiparalle（反向平行）：DNA双链沿相反的方向构成，一条链的5端对应另一条链的3端。Ø Base pairing（碱基配对）：在DNA双链中碱基存在特异的相互作用，AT互补，CG互补，以氢键结合。Ø Complementary（互补）：碱基配对是由DNA双链中的配对作用决定的，AT配对，CG配对。Ø Supercoiling（超螺旋）：空间中闭环双链DNA进一步旋曲形成的三级结构。5. 基因gene：基因是指存在于细胞内有自体繁殖能力的遗传单位，这种单位在染色体上占有一定位置而作直线排列。基因是具有特定的核苷酸顺序的核酸分子中一个片段，是携带有特定遗传信息的功能单位。 6. DNA一级结构DNA分子中核苷酸的排列顺序（即碱基顺序）7. DNA二级结构双螺旋double helixv 主链（backbone）：脱氧核糖和磷酸基通过酯键交替连接而成。二条主链绕一共同轴心以右手方向盘旋、反向平行形成双螺旋构型。主链处于螺旋外则。v 碱基对（base pair）：碱基位于螺旋的内则，以垂直于螺旋轴的取向通过糖苷键与主链糖基相连。同一平面的碱基在二条主链间形成碱基对。配对碱基总是A与T和G与C。碱基对以氢键维系，A与T间形成两个氢键，G与C间形成两个氢键。v 大沟和小沟：大沟和小沟分别指双螺旋表面凹下去的较大沟槽和较小沟槽。小沟位于双螺旋的互补链之间,而大沟位于相毗邻的双股之间。这是由于连接于两条主链糖基上的配对碱基并非直接相对, 从而使得在主链间沿螺旋形成空隙不等的大沟和小沟。 在大沟和小沟内的碱基对中的N和O原子朝向分子表面。v 结构参数：螺旋直径2nm；螺旋周期包含10对碱基；螺距3.4nm；相邻碱基对平面的间距0.34nm。8. DNA构象的多样性Ø B-DNA, A-DNA, C-DNA, D-DNA, S-DNA 的共同特征：右手双螺旋。 Ø Z-DNA：嘌呤与嘧啶交替排列(GGCGCG)；左手双螺旋；只有一个螺旋沟，狭而深；细胞DNA分子中确实存在Z-DNA。9. DNA三级结构包括：链的扭结和超螺旋、单链形成的环、环状DNA的连环体。10. 检测DNA三级结构的方法类型形态拓扑结构电泳迁移率I闭合环超螺旋最快II开环松弛型最慢III线性松弛型中等速度Ø 密度梯度离心Ø 凝胶电泳àØ 电镜观察11. GC含量： DNA的碱基组成通常用GC百分含量表示，注意所谓百分含量是指摩尔百分比。12. 变性&复性Ø 变性（denaturation）/解链（melting）：稳定的双螺旋结构DNA分子由于维持稳定性的氢键和疏水键的断裂，松解为无规则线性结构的现象。不涉及一级结构的改变，导致一些理化性质的变化。Ø 复性（renaturation）：指变性DNA 在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象,它是变性的一种逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性,此过程称为“ 退火”(annealing)。13. 增色效应/高色效应(hyperchromic effect)：核酸在紫外光260nm具有强烈的吸收峰。结构越有序，吸收的光越少。即游离的核苷酸比单链的RNA或DNA吸收更多的光，而单链RNA或DNA的吸收又比双链DNA分子强。当DNA变性时，其光吸收值增加，这种现象即为增色效应；反之为减色效应。14. 变性温度/融解温度(Tm)：变性过程中在非常狭窄的温度范围内，紫外增色效应会出现一个飞跃。紫外吸收值发生跳跃的温度称为DNA的融点。Tm值实际上是目标DNA的一半变性时的温度，它受DNA碱基组成和变性条件的影响。15. Cot1/2：标准条件下（一般为0.18ml/L阳离子浓度）测得的复性率达1/2时的Cot值。该值与核苷酸对的复杂性成正比。Co为单链DNA的起始浓度,t是以秒为单位的时间。16. 核酸分子杂交技术原理：分子杂交（简称杂交，hybridization）是核酸研究中一项最基本的实验技术。其基本原理就是应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不同的DNA（或RNA）片段，按碱基互补关系形成杂交双链分子（heteroduplex）。杂交双链可以在DNA与DNA链之间，也可在RNA与DNA链之间形成。17. PCR技术原理：以合成的两条已知序列的寡核苷酸为引物，在DNA聚合酶作用下，利用dNTP为原料，将位于两引物之间的特定DNA片段进行复制。这样经过变性、退火、延伸一个循环，每一个循环的产物作为下一个循环的模板，如此循环30次。每完成一个循环需24分钟，23h就能将带扩目的基因扩增放大几百万倍。18. 有关DNA双链的几个概念：Ø 转录（transcription）：根据DNA模板合成RNA的过程，通过转录得到几种不同的RNA，其中三中典型的RNA为mRNA、tRNA和rRNA。Ø Coding strand编码链/sense strand有义链：该链的序列与mRNA相同。Ø Template strand模板链/antisense strand 反义链：该链的DNA序列通过碱基互补指导mRNA的合成，该链的序列与mRNA互补。19. tRNA的结构与功能ètRNA的二级结构三叶草形v 氨基酸接受臂：由5端和3端碱基配对形成，在3端有一个游离的CCA顺序，此臂负责携带特异的氨基酸。氨基酸通过共价键与A上的2-OH或3-OH相连。v TC臂：是假尿嘧啶。该臂常由5bp的茎和7Nt环组成,一般均存在TC的顺序，负责和核糖体的rRNA识别结合 。 v 反密码子臂：常由5bp的茎区和7Nt的环区组成，在反密码子环的中间是三联的反密码子，负责和密码子的识别。v 二氢尿嘧啶臂（D臂）：名称由来源于环中含有二氢尿嘧啶，茎区长度为4bp，负责和氨基酰tRNA聚合酶结合。 v 额外臂：变化最大的区域，可分为两类，一类仅含3-5个核苷酸，另一类含有一条较大的臂，其功能是在tRNA的L型三维结构中负责连接两个区域（D环反密码子环和TC-受体臂）。ètRNA的三级结构倒L型（靠氢键维持）D环和TC环形成了“L”的转角，氨基酸受体臂位于L型的一侧，距反密码子环约70A。这种结构与AA-tRNA合成酶对tRNA的识别有关。受体臂顶端的碱基位于“L”的一个端点，而反密码子臂的套索状结构生成了“L”的另一端点，分子中两个不同的功能基团是最大限度分离的。这个结构形式满足肽链合成延伸位点与mRNA分别位于核糖体大、小亚基的空间结构的要求。ètRNA的功能：tRNA作为连接子（adaptor）介导了mRNA中的三联体密码子与氨基酸之间的相互关联。tRNA具备作为“接头”的双重特性，既能识别氨基酸也能识别密码子。3末端的腺苷酸可与一氨基酸共价连接，反密码子则与mRNA中的密码子碱基配对。在逆转录中作为合成互补DNA链的引物。参与细菌细胞壁、叶绿素、脂多糖和氨酰磷脂酰甘油的合成。ètRNA的种类：起始tRNA（能特异地识别mRNA模板链上起始密码子的tRNA） 原核生物中，起始tRNA携带甲酰甲硫氨酸（fMet）真核生物中，起始tRNA携带甲硫氨酸（Met）延伸tRNA同工tRNA：一种氨基酸可能有多个密码子，为了识别也就有多个tRNA，即多个tRNA代表一种氨基酸，这些tRNA称为。校正tRNA：由校正基因突变产生，通过改变反密码子区校正无义突变和错义突变。无义突变（无义抑制）：某个核苷酸的改变提前产生了终止密码子，合成无功能的多肽。错义突变（错义抑制）：某个核苷酸的改变造成了肽链合成的错误。20. rRNA生物种类大小亚基各亚基组成原核生物70s大亚基 50s23s5s小亚基30s16s真核生物90s大亚基60s28s5.8s5s小亚基40s18s 真核生物&原核生物mRNA的比较示意图21. mRNAè单顺反子（Monocistronic）：mRNAs represent only a single gene。è多顺反子（Polycistronic）：sequences coding for several proteins。比较项目原核生物真核生物稳定性半衰期短半衰期长结构多为多顺反子（操纵子）：前导序列+编码区+尾巴多为单顺反子起始密码子AUG，有时是GUG或UUG特殊性在AUG上游7-12个核苷酸处有一5AGGAGG3序列，称SD顺序。这段序列与16S rRNA 3末端反向互补，与mRNA和核糖体的结合相关，因此会影响蛋白质的翻译。mRNA的5端都有一个帽子结构；绝大多数真核生物mRNA具有poly(A)尾。转录&翻译原核生物mRNA的转录和翻译发生在同一细胞空间，而且两个过程几乎同时发生。真核生物是在核内转录，细胞质内翻译。22. 真核生物mRNA的“帽子”结构真核基因转录常从嘌呤核苷三磷酸(A,G)开始，第一个核苷酸保留5三磷酸基团，以3位与下一核苷酸5位形成磷酸二酯键。转录起始序列可示为5PPPAPNPNPNP.；转录后由鸟苷酰转移酶催化在5加G，G与起始核苷酸是以5-5三磷酸键相连；这一结构称为“帽子”，5GPPPAPNPNPNP.第一个甲基位点在5端鸟嘌呤7位上，所有真核生物中均存在。具有该甲基化基团的帽子称帽子0；甲基加到次末端碱基上，具有两个甲基基团的帽子叫帽子1。以帽子1为底物，在第三个碱基再加上一个甲基，则称帽子2。23. mRNA 的poly(A)尾大多数真核mRNA的3端有多聚腺苷酸序列；poly(A)序列不是DNA编码，是转录后加上的；mRNA初进入细胞质时，其poly(A)尾长度大致与核中长度相同，随后逐渐缩短。组蛋白mRNA不含poly(A) 结构。可以防止mRNA降解，提高mRNA稳定性；mRNA穿越核膜由细胞核进入细胞质的必需形式。第2章 基因的组织与结构主要内容：第一节 基因与基因多样性 第二节 基因组的结构与功能 第三节 染色体外遗传因子1. 断裂基因（split genes）真核生物的结构基因是断裂基因。一个断裂基因能够含有若干段编码序列，这些可以编码的序列称为外显子。在两个外显子之间有一段不变吗的间隔序列称为内含子。每个断裂基因在第一个和最后一个外显子的外侧各有一段非编码区，称为侧翼序列，在侧翼序列上有一系列的调控序列。外显子exon：基因编码区中能够表达肽链的部分。内含子intron：基因编码区中的非编码序列，不能表达肽链。2. 外显子捕捉（exon trapping）Exon trapping is a molecular biology technique to identify potential exons in a fragment of eukaryote DNA of unknown intron-exon structure. This is done to determine if the fragment is part of an expressed gene.The genomic fragment is inserted into the intron of a 'splicing vector' consisting of a known exon - intron - exon sequence of DNA. If the fragment does not contain exons (i.e., consists solely of intron DNA), it will be spliced out together with the vector's original intron. On the other hand, if exons are contained, they will be part of the mature mRNA after transcription (with all intron material removed). The presence of 'trapped exons' can be detected by an increase in size of the mRNA.3. 基因家族gene familyØ 基因家族（gene family）：来自于一个共同的祖先基因，通过复制和变异形成的结构、功能相似的基因群体；家族成员其外显子具有相似性。Ø 基因簇（genen cluster）：位于同一染色体上彼此相邻近的一组相同或相关基因称为基因簇。Ø 基因家族中的成员常集串联排列构成基因簇；但也可以不集中在一起，也分布在不同的染色体上。Ø 多基因家族（multigene family）：多基因家族是基因组中功能相似、进化上同源的一组基因。在这些基因中，拷贝数、顺序保守性、构成、分布状态和功能相关性有很大差异。Ø 超基因家族（supergene family）：DNA序列相似，但功能不一定相关的若干基因家族或单拷贝基因总称。4. 简单的多基因家族典型例子rRNA基因家族转录单元rRNA基因家族转录单元结构相似，中度重复，在基因组中分散成若干个基因簇。真核生物rRNA基因通过重复单元构成基因簇，重复单元包括转录单元和非转录区，18-5.8-28S为同一转录单元，转录单元包括转录序列和将转录序列分隔开的转录间隔区；简单的基因家族中转录单元保守性很高；转录单元内转录间隔区序列变化大；非转录区在不同生物中，甚至在同种生物中变化也很大。在非转录区中，长度固定区域与可变区域相间排列；可变区域由短重复序列组成，重复次数变化导致非转录区序列长度差异；最前端的固定区域其序列和长度与其它固定区域不同；后三个固定区域称做Bam Island；每个重复固定区域都含有启动子序列，这有利于rDNA在需要时高效表达。5. 假基因（pseudogene）：核苷酸序列通相应的正常功能基因基本相同，但不能合成功能蛋白的失活基因。6. 重叠基因（overlapping gene）：同一DNA序列有两种不同的阅读框架，得到不同肽链，即两个基因共同使用同一DNA序列，却编码两种不同的蛋白质。基因重叠现象的发生是由于读码框架“偏移”所致。在真核生物中也存在。7. 转座子（transposon）：是指不依赖序列的同源性，能够随意将自身转移到基因组上的DNA序列。8. 真核生物玉米中的转位因子（一）Ds/Ac组Ø C基因：位于第9染色体上，是合成紫糊粉层色素所必须的基因，如果它失去正常功能，糊粉层无色。Ø Ds因子(dissociator)：可以从一个座位跳到另一个座位，在基因组内转座；也可使染色体断裂，引起缺失或重组。但是它的移动必须在另一个基因Ac存在时才能进行，Ds是非自主因子。Ø Ac因子(activator)：与Ds有同源性，当Ac因子存在时，Ds因子才能转移，Ac是自主因子。Ø AC有两个基因，转位酶基因编码转位酶，另一个基因可能是编码定位酶;Ø Ac因子和 Ds因子序列相似性很高，区别在于Ds因子发生转位酶基因缺失；Ø AC和DS两端有反向重复，是转位酶的识别标志，因此均可发生转位。（二）Spm因子组Ø A基因：合成糊粉层所必须的基因，正常表达时糊粉层呈紫色；Ø 正常的Spm因子：类似于Ac因子，它能起抑制子（suppressor）和诱变子（mutator）的双重作用。Ø 有缺陷的Spm因子：抑制功能不完全，糊粉层呈淡紫色，正常Spm可帮助其实现完全抑制；不能转位，但在正常的Spm因子存在时能够转位。Ø 转位有缺陷的Spm因子：无抑制功能，但在Spm因子帮助下能起抑制作用；转位功能缺陷，即便是在Spm因子存在时也不能转位。Ø 周期性的Spm因子：其抑制功能交替开关。9. 细菌的转位因子（1）、插入序列（IS）：一类自主单位，除了含有自身转位作用的基因外不含其它基因，两端有对称的反向重复序列，转位因子转位时，基因组上的靶序列发生倍生，使插入序列的两端各有一段同向重复序列。（2）、转座子（Tn）：除含有转为相关的酶基因外，还带有抗性基因。转座子可分为两个亚类：I 型转座子两末端由IS构成；II型II 末端由反向重复序列。10. 转位因子的结构特点Ø 在转位因子的两端存在末端反向重复序列（TIR），它们在转位过程中至关重要；Ø 绝大多数转位因子含有开放读框（ORF），可能编码一种酶，其功能促进转位因子的转位；Ø 受体DNA上存在很短的一段靶序列，由于转位因子的插入，在转位因子的两侧形成正向重复序列，靶序列的长短对每类转位因子都是特异的。11. 转位机制：复制型转座(replicative transposition)：转位因子的一个拷贝插入到靶位点，而另一拷贝则仍然保留在给体原来的位置上。非复制型转座(conservative transposition)：在转位酶的作用下，转位因子从原来位点上删除下来，再转移插入到另一个位点。12. 转座子转座的特征：Ø 转座不依赖于靶序列的同源性；转座后靶序列重复；转座子的插入具有专一性；转座具有排他性-转座免疫；转座具有极性效应；活化邻近的沉默基因；区域性优先。13. 反转座子（retroposons）：基因结构与逆转录病毒的原病毒类似，指通过RNA为中介，反转录成DNA后进行转座的可动元件，其最大的特点是编码的多肽具有逆转录酶的活性。14. 基因组genome：是指细胞或生物体的全套（单倍体）遗传物质的总和。15. C值：一个单倍体基因组的DNA含量即该物种DNA的C值，某一特定物种其C值是恒定的。16. C值矛盾（C value paradox）：一般而言，随着进化，生物体的结构与功能趋于复杂，其C值增大。但某些生物其基因组的大小与基因组的复杂度缺乏相关性，即C值矛盾。C值矛盾表现为：u C值不随生物的进化程度和复杂性而增加；u 关系密切的生物C值相差很大；u 真核生物DNA的量远大于编码蛋白质等物质所需的量。17. 病毒&原核&真核生物基因组特征比较类别病毒原核生物真核生物特点基因组小，但相差较大；基因组可以是DNA组成，也可以是RNA组成，但是只能有一种；可以是环状，也可以是线性，可以是单链，也可以是双链，形式多样；多数RNA病毒基因组由连续的核糖核酸链组成；基因重叠；基因组大部分用于编码蛋白质，小部分不翻译；功能相关的基因常丛集形成一个功能单位或转录单位，一起转录形成多顺反子mRNA；除反转录病毒外，基因组都是单倍体；噬菌体基因是连续的，真核病毒有内含子，基因不连续。无细胞核，染色体聚集成较为致密的类核；基因组较小，基因数目少，大多只含有一条环状染色体，只有一个复制起点；基因结构紧凑，大多编码蛋白质，不会出现基因重叠现象；具操纵子结构；结构基因大都是单拷贝的，rRNA的基因往往多拷贝；DNA分子中具有各种功能的识别区域；在基因或操纵子的末端有特殊的终止顺序，可以终止转录。远大于原核生物的基因组，多复制起点，复制子较短；DNA与蛋白质结合形成染色体，一般为多条；基因转录产物为单顺反子；基因组中不编码的区域多于编码的区域；存在重复序列，大部分基因有内含子，基因是不连续的。18. 回文序列（palimdrome）：由两个相同顺序的互补拷贝在同一DNA链上反向排列而成，其间没有间隔，称为。19. 卫星DNA（satellite DNA）：有重复单位串联排列组成的一类高度重复序列，由于这类序列的碱基组成不同于其他组分，可以用密度梯度离心将其与主体DNA分开，称为。往往集中于异染色质。20. 小卫星DNA：15bp左右的串联重复序列组成，位于邻近染色体末端的区域(端粒)，有些也分散在基因组的多个位置上，一般没有转录活性。21. 微卫星DNA：重复单位仅有2-5bp，如(CA)n，(GT)n，(GAA)n等，分散存在于基因组中。22. HGP人类基因组计划四张图谱Ø 遗传图谱（genetic map）又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离（cM）为图距的基因组图。Ø 物理图谱(physical map)是指特定的DNA片段在大片段DNA或基因组DNA中的位置关系和排列顺序，包括DNA克隆片断重叠群图，大片段内切酶位点图、DNA序列路标图等。Ø 序列图谱(sequence map)是指基因组DNA中核苷酸的排列顺序。Ø 转录图谱(transcription map)是在识别基因组所包含的蛋白质编码序列的基础上绘制的结合有关基因序列、位置及表达模式等信息的图谱。23. 单体型（haplotype）：对于多基因座复等位基因遗传系统而言，每条染色体上带有分属各个基因座上的某个等位基因。一条染色体上这些不同的等位基因组合就是不同的单体型。 “国际人类基因组单体型图计划”（HapMap）是继“国际人类基因组计划”之后，人类基因组研究领域的又一重大研究计划。科学家们将在已完成的人类全基因组序列图的基础上，确定人类经世代遗传仍保持完整的单体型图。以及在不同族群中这些单体型的类型与分布。并将这些不同的单体型标上标签。24. HGP中两种测序策略分级鸟枪法全基因组鸟枪法25. 质粒（plasmid）：质粒是细菌染色体外的遗传物质，是环状闭合的双链DNA。带有遗传信息，能自行复制，随细菌分裂转移到子代细胞，并非细菌生长所必需。26. 质粒的一般分子特性：稳定游离于染色体外，一定条件下可整合到染色体上，有三种构型：共价闭合环状，开环结构和线性分子。电泳时，移动速率不同。27. 质粒DNA的转移Ø 接合型质粒：能自我转移。Ø 非接合型质粒：质粒DNA的迁移作用，由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，即质粒的迁移作用。28. 质粒的复制类型严紧型(stringent)质粒：拷贝数低， 每细胞1-3拷贝。松弛型(relaxed)质粒：高拷贝数，每个寄主细胞中可高达10-60份拷贝。24. 质粒的不亲和性（plasmid incompatibility）：无选择压力情况下，亲缘关系密切的质粒不能在同一细胞中稳定共存的现象。25. F质粒：一种感染性质粒，不仅自身能转移，而且能移动部分染色体。首先发现于大肠杆菌。F质粒的应用：构建细菌人工染色（Bacterial Artificial Chromosome, BAC）。BAC：细菌人工染色体是以F因子的复制子为基础构建成的一种大片段DNA克隆载体。YAC：利用酵母着丝粒载体所构建的大片段DNA克隆。克隆载体上含有着丝粒、端粒、可选择标志基因、自主复制等序列，可携带插入的大片段DNA(1001000 kb)在酵母细胞中有效地复制，如同微小的人工染色体。是基因组研究的有用工具。26. 分子标记技术指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质特点：(1)具有高的多态性；(2)共显性遗传；(3)能明确辨别等位基因；(4)遍布整个基因组，分子标记均匀分布；(5)检测手段简单、快速；(6) 开发成本和使用成本尽量低廉；(7)在实验室内和实验室间重复性好（便于数据交换）。限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）RFLP是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小，反映DNA分子上不同酶切位点的分布情况，因此DNA序列上的微小变化，甚至是一个核苷酸的变化，也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生，导致酶切片段长度的变化。RFLP标记的等位基因具有共显性的特点，结果稳定可靠，重复性好，特别适应于构建遗传连锁图。随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）RAPD是建立于PCR技术之上的分子标记技术，基本原理是利用一个随机引物（8-10个碱基）通过PCR反应非定点的扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分离扩增片段来进行DNA多态性研究。对任一特定引物而言，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物的数量和大小发生变化，表现出多态性。RAPD检测速度快，DNA用量少，实验设备简单，不需DNA探针，用一个引物就可以扩增出许多片段。简单序列重复多态性（Simple Sequence Repeats Polymorphism，SSR）也称为微卫星DNA，是一类由几个碱基组成的基序串联重复而成的DNA序列，其中最常见的就是双核苷酸重复，每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10-60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。不同遗传材料重复次数不同，导致了SSR长度的高度变异性，这一变异性正是SSR标记产生的基础。基本原理：根据微卫星重复序列两端的特定段序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列重复数目不同，扩增出来不同长度的PCR产物，这是检测DNA多态性的一种有效方法。单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP） 是指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异，这种差异包括单个碱基的缺失或插入，更常见的是单个核苷酸的替换，且常发生在嘌呤碱基和嘧啶碱基之间。SNP技术可以帮助区分两个个体遗传物质的差异，被认为是应用前景最好的遗传标记。第3章 遗传物质的复制主要内容：第一节 核酸复制的特征第二节 参与复制的酶和蛋白质因子第三节 原核生物的复制机理第四节 病毒基因组复制的多样性第五节 真核生物的DNA复制第六节 复制的忠实性û1. 核酸生物合成的一般规则：Ø 按照碱基配对原则，以现有的DNA链为模板合成新拷贝；部分DNA是以RNA为模板反转录的结果；Ø 核酸的生物合成只能从5à3方向进行；Ø 特异的聚合酶类催化核酸的生物合成；Ø 聚合酶的底物核苷酸是5NTP或5dNTP；Ø DNA聚合酶不能催化从头开始合成DNA，必需具有引物。2. 半保留复制（Semi-conservative Replication）：DNA复制是分别以亲代螺旋双链中的一条为模板合成其互补链，由此产生的两条子代双螺旋都是由一条亲代链和一条新合成链组成，因此称做半保留复制。3. 复制子（replicon）：基因组中DNA分子的复制单位，含有控制复制起始的特定位点，即复制起始点，以及控制复制终止的终止点。因此复制子是从复制起点到终止点的区域。原核生物：一个复制子，环状。真核生物：多个复制子，线性。4. 复制叉（replication fork）：DNA复制过程中亲本双螺旋DNA两条单链解离的位点，由于双链解离从而呈现叉状。复制方向：单向&双向。5. 复制方式：1）线形DNA双链的复制 线性DNA双链的复制叉生长方式有单一起点的单向及双向和多个起始点的双向，复制叉处呈现“眼”型；2）环状DNA双链的复制¡ q型大肠杆菌DNA复制中间体就是q型，环状双链DNA分子复制时形成两个方向相反的复制叉；¡ 滚环型一种单向复制方式；如FX174。¡ D-环型一种单向复制的特殊形式，两条链的复制起点不重合，各有一复制起点，如动物线粒体。6. 半不连续复制（Semidiscontinuous Replication）：DNA以两条亲本链为模板合成子链时，一条子链的合成是连续的，另一条是不连续的。7. 前导链与后滞链（leading and lagging strand） DNA双链复制时，一条子链沿自身53方向持续合成，即前导链；而另一条子链的合成是不连续的，即后滞链。8. 冈崎片段(Okazaki fragment)：后滞链合成时，先以亲本链为模板按53方向合成出许多1kb-2kb的不连续片段，这些片段被称做冈崎片段；然后这些短片段共价联结成一条完整的后滞链，后滞链的成长方向与其片段的合成方向相反。 9. 参与复制的酶及其重要作用复制体成分在复制中的功能DNA解旋酶DNA拓扑异构酶单链结合蛋白SSBDNA聚合酶DNA连接酶引发酶RNaseH使复制叉前面的DNA解链，提供单链模板。释放因解旋酶的活性而造成的扭曲链，复制后使松弛的DNA双链恢复负超螺旋；稳定复制叉的单链区域，与其他组分作用以激活其活性。多种形式，分别负责先导链的合成，后滞链的合成及后滞链的修复连接修复的后滞链片段，专门催化“缺刻”。只连接单链。DNA合成过程中RNA引物的合成，反复起始冈崎片段。切除RNA引物10. DNA酶的特性： 1）底物必须是dNTP； 2）以DNA为模板，链延伸功能，不能从头开始合成； 3）合成方向只能是53。11. 大肠杆菌DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶IIII功能添补后滞链的间隙及负责损伤DNA的修复DNA复制必需，随复制叉移动延长新生链。特性53方向核酸外切酶活性，能切除引物RNA。35核酸外切校正活性，保证复制的准确性。12. 缺刻平移（nick translation）：大肠杆菌DNA聚合酶（53方向核酸外切酶活性）可利用双螺旋DNA链上由一个磷酸二酯键断裂产生的缺刻，将一条单链降解并从缺刻的3-OH端合成一条新链替代降解的同源链，这一过程称缺口平移。利用DNA聚合酶I可进行体外的DNA放射性标记。13. DNA聚合酶III全酶装配模型Ø a、e、q亚基组成核心酶，是催化核心; Ø t亚基连接核心酶形成二聚化; Ø b亚基是进行性因子，以二聚体形式形成一个可以沿DNA滑动的“滑动夹”，使核心酶附着于模板; Ø g亚基只与一个单体结合， g复合物控制了酶的进行性，即b亚基在DNA上的定位和解离都需要g复合物.14. 真核生物DNA聚合酶 聚合酶类型DNA聚合酶aDNA聚合酶dDNA聚合酶gDNA聚合酶e位置功能 细胞核引发和起始复制细胞核链延伸线粒体线粒体复制细胞核后随链完成修复15. 双连复制的回环模型Ø DNA聚合酶III是不对称二聚体，有两个DNA合成的催化中心；Ø 在复制叉处，DNA聚合酶III和引发体以及其他复制蛋白构成复制复合体；Ø 每个复制中心含有两个b亚基；t亚基负责将DNA聚合酶III结合为二聚体。Ø 全酶是不对称的，只有一个g复合物。Ø DNA复制延伸时，前导链和后滞链的合成各利用DNA聚合酶III的一个催化中心；Ø 后滞链的模板围绕其中一个催化中心折叠成环状，使后滞链方向颠倒，但生化反应方向不变。使前导链和后滞链同时合成。Ø 环上RNA引发酶形成引物，DNA聚合酶随后延伸，DNA聚合酶沿复制叉移动，复制片段延长，环变大，直至遇到下一个冈崎片段，释放环。Ø 模型的关键在于前导链与后滞链合成的进行性及DNA聚合酶的不对称性。16. 终止子(terminator)：染色体和质粒DNA中复制终止的特定序列。17. 线形DNA复制存在的问题5末端“隐缩”对策：¡ 线状DNA环化（l噬菌体）或连成多聚体（T7噬菌体）；¡ DNA形成特殊结构，如末端产生发夹，不产生自由末端；还可以形成十字交叉结构，如草履虫线状线粒体DNA复制；¡ 专一性蛋白与末端作用保证其引发，腺病毒、X29噬菌体等线性病毒核酸有蛋白与5末端碱基共价相连。¡ 可变末端，真核生物DNA