免疫荧光染色步骤.doc

Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-date免疫荧光染色步骤免疫荧光染色步骤免疫组织化学染色步骤1将石蜡切片二甲苯脱蜡（二甲苯20min二甲苯10min）、入水（100%酒精5min100%酒精3min95%酒精2min80%酒精1min70%酒精1min），蒸馏水冲洗后，0.01M PBS冲洗，5min×3次；2枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，加热使水温达92-96，维持10-15min，自然冷却至室温，0.01M PBS冲洗，5min×3次；33%H2O2溶液，37，20 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，0.01M PBS冲洗，5min×3次；4正常羊血清封闭，37，30 min；5倾去多余血清，滴加一抗，372小时或者4过夜，0.01M PBS冲洗，5min×3次；6滴加二抗工作液，37，30 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次；7滴加三抗工作液，37，30 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次；8DAB避光显色，显微镜下控制显色时间；90.01M PBS终止显色；10梯度酒精脱水（70%酒精1min80%酒精1min95%酒精1min 95%酒精1min无水酒精10min无水酒精10min），二甲苯透明（二甲苯15min二甲苯10min；11中性树胶封片。免疫荧光染色步骤(1)将组织切片脱蜡入水；(2)抗原微波修复，温度92-96，10-15min，自然冷却至室温；(3)正常羊血清封闭，37，60 min；(4)倾去多余血清，滴加一抗，372小时或者4过夜，PBS冲洗，5min×3次；(5)滴加荧光素标记的二抗，避光，37，60 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次；(6)防淬灭封片剂封片，4，避光保存。(7)荧光显微镜观察拍照。细胞免疫组化染色（培养板中染色）1培养的细胞，弃去培养基，冷的PBS洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200l）固定10min，PBS洗2次，每次510分钟。2在含0.1% Triton X-100（4孔板200l）的PBS中进行10min的透膜处理，PBS洗2次，每次5-10分钟。手动轻轻晃动数次，吸尽液体。3羊血清用PBS配制成4羊血清封闭液，室温封闭（4孔板200l）30分钟。4吸尽液体，勿洗，添加一抗，于37条件下孵育1h或放在4冰箱过夜，PBS洗3次，每次5-10分钟。5去除一抗后，细胞用PBS洗三次。6加入二抗，然后加入相对应的孔，在37下作用30-60min。PBS洗3次，每次5-10分钟。7吸尽液体，加入三抗，在室温条件下作用30-60min。PBS洗3次，每次5-10分钟。同时采用不添加一抗，而仅添加二抗及三抗的细胞作为阴性对照组。8DAB避光显色，显微镜下控制显色时间；9PBS终止显色；显微镜下观察拍照。细胞免疫荧光染色（培养板中染色）1培养的细胞，弃去培养基，冷的PBS洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200l）固定10min，PBS洗2次，每次510分钟。2在含0.1% Triton X-100（4孔板200l）的PBS中进行10min的透膜处理，PBS洗2次，每次5-10分钟。手动轻轻晃动数次，吸尽液体。3羊血清用PBS配制成4羊血清封闭液，室温封闭（4孔板200l）30分钟。4吸尽液体，勿洗，添加一抗，于37条件下孵育1h或放在4冰箱过夜，PBS洗3次，每次5-10分钟。5去除一抗后，细胞用PBS洗三次。6滴加荧光素标记的二抗，避光，37，60 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次；7防淬灭封片剂封片，4，避光保存。8荧光显微镜观察拍照。细胞爬片后的步骤同切片的免疫组织化学及免疫荧光的步骤。HE染色1. 石蜡切片常规脱蜡入水：二甲苯、各15min100%酒精、95%酒精、80%酒精70%酒精50%酒精各1-2min。2水洗：普通水洗2次，蒸馏水洗1次。3. 苏木素染色10min。4. 充分水洗：自来水洗10min。5. 盐酸酒精分色：分色10-30s，随时镜检分色程度，使不该着色的部分全部褪去，应着色的部分着色适当。着色标准：胞核为深蓝色，胞质无色或浅灰色。6. 充分水洗：自来水洗10min。7. 氨水蓝化2-3min。8. 充分水洗：自来水洗10-15min，水洗后若染色太浅则可重新返回苏木素。9. 脱水：70%、80%酒精各1-2min。10. 伊红染色0.5min左右，随时镜下观察，染色不宜过深，要与苏木素作对比，要协调鲜明。11 脱水透明：95%酒精、各1-2min100%酒精、各15min二甲苯、各15min。12中性树胶封片。-