反相高效液相色谱衍生化法测定氨基葡萄糖原料及其制剂的含量-百(精).doc

Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-date反相高效液相色谱衍生化法测定氨基葡萄糖原料及其制剂的含量-百(精)反相高效液相色谱衍生化法测定氨基葡萄糖原料及其制剂的含量-百(精)反相高效液相色谱衍生化法测定氨基葡萄糖原料及其制剂的含量王英瑛1, 2, 李 俊2, 曾 苏1(1. 浙江大学药学院, 杭州 310030; 2. 浙江省台州市药品检验所, 318000摘 要 目的 建立反相高效液相色谱衍生化法测定氨基葡萄糖盐酸盐和氨基葡萄糖硫酸盐及其制剂含量的方法。方法 在三乙胺存在的碱性条件下, 氨基葡萄糖溶液中加入芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺(FM OC -O Su 进行衍生化反应, 采用岛津Sh i m -pack V P -OD S C 18色谱柱(250mm 4. 6mm , 5 m , 乙腈-磷酸盐缓冲液(p H 值2. 5 (40 60 为流动相, 梯度洗脱, 流速1. 0mL m in -1, 检测波长:265n m, 对衍生化反应条件进行考察。结果 最适宜的衍生化反应条件为:FMO C -OSu 溶液、三乙胺溶液浓度分别为0. 4%, 0. 2%, 水浴温度为60 , 反应时间为30m i n ; 氨基葡萄糖的线性范围为0. 43. 0mg mL -1, 4个样品的平均回收率分别为100. 1%, 100. 3%, 99. 3%, 99. 9%。结论 该方法简便准确, 专属性、重复性好, 可用于氨基葡萄糖及其制剂的质量控制。关键词氨基葡萄糖; 色谱法, 高效液相, 反相; 衍生化法中图分类号 R 927 文献标识码 A 文章编号 1004-0781(2008 07-0851-02氨基葡萄糖(2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖, 简称GA 与人体关系密切, 广泛存在于人体内, 可以减少血浆中一氧化氮、前列腺素E 2等的生成, 抑制血小板的聚集, 但都以结合型存在而无游离型, 主要以3种方式存在:氨基葡萄糖盐酸盐、氨基葡糖糖硫酸盐和N-乙酰氨基葡萄糖1。氨基葡萄糖是关节滑液、软骨基质等器官组织的组成原料, 具有抗炎和保护、营养关节和软骨的作用, 已作为保健食品应用于人群1, 2, 还可应用于食品、化妆品和饲料添加剂中, 用途相当广泛。因此建立氨基葡萄糖含量的检测方法, 控制这类药品和保健食品的质量很有必要。已报道的氨基葡萄糖测定方法有滴定分析法2、比色法24和高效液相色谱(H PLC 法5, 6。笔者采用衍生化方法, 通过在氨基葡萄糖溶液中加入芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺衍生化反应生成衍生物后经反相高效液相色谱(RP-H PLC 法测定氨基葡萄糖含量, 方法简便, 结果准确可靠。1 仪器与试药1. 1 仪器 W aters A lliance 高效液相色谱仪, 包括2695Separati onsM odu l e 二元泵、在线真空脱气机、自动进样器、柱温箱, W aters2996二级管阵列检测器, Empo w er 色谱工作站。1. 2 试药 氨基葡萄糖盐酸盐对照品为 美国药典 (U SP 标准品, 乙腈(色谱纯, 美国Burdick &Jackson 公司, 芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺(FMO C -OSu , 99% 为分析纯, 其他试剂均为分析纯试剂, 流动相用水为去离子水。氨基葡萄糖盐酸盐和氨基葡萄糖硫酸钾盐原料由某生物化学有限公司提供, 氨基葡萄糖盐酸盐片和氨基葡萄糖硫酸钠盐胶囊分别由市场购买。2 方法与结果2. 1 色谱条件 色谱柱:岛津Shi m -pack VP C 18(150mm 4. 6mm, 5 m , 柱温:30 , 流速:1. 0mL m i n -1, 检测波长:收稿日期 2007-06-29作者简介 王英瑛(1977-, 女, 浙江台州人, 主管药师, 在读硕士, 主要从事药物分析研究。电话:0576-8552833, E-m a i :l y i ngyw ang hot ai. l 265n m, 流动相为梯度浓度:A-乙腈, B -磷酸盐缓冲液(p H 值=2. 5, 比例为40 60。梯度洗脱程序如下:04m i n , A B 为40 60; 9m i n , A B 为90 10; 接着等度洗脱1m i n ; 14m i n , A B 为40 60。2. 2 溶液配制 对照品溶液:精密称取氨基葡萄糖盐酸盐对照品20m g 于10mL 容量瓶中, 加水溶解, 稀释至刻度。供试品溶液:氨基葡萄糖盐酸盐, 氨基葡萄糖硫酸钾盐, 氨基葡萄糖盐酸盐片剂, 氨基葡萄糖硫酸钠盐胶囊适量, 加水超声溶解, 定容至刻度, 片剂和胶囊溶液用滤纸过滤后, 取续滤液备用。2. 3 衍生化反应条件的选择2. 3. 1 衍生化反应步骤 精密量取对照品溶液或样品溶液1. 0mL 置50mL 容量瓶中, 加入0. 2%三乙胺溶液1mL 和0. 4%的F M OC -O Su 乙腈溶液5mL , 摇匀, 置60 水浴中加热30m i n , 再立即加入冷的乙腈-磷酸盐缓冲液(40 60 的流动相使反应停止, 并稀释至刻度, 摇匀, 用孔径0. 45 m 微孔滤膜过滤后即得。2. 3. 2 衍生化试剂浓度的确定 分别采用0. 05%, 0. 10%, 0. 20%, 0. 30%, 0. 40%, 0. 50%的FMO C -OSu 乙腈溶液对对照品溶液进行衍生化反应, 进样后考察峰面积的变化, 结果表明, 当浓度为0. 40%时, 氨基葡萄糖总峰面积不再增加, 故选择FM OC -O Su 乙腈溶液的浓度为0. 40%。2. 3. 3 三乙胺浓度的选择 考察三乙胺浓度分别为0. 02%, 0. 05%, 0. 10%, 0. 20%, 0. 40%, 0. 60%, 0. 80%时反应后氨基葡萄糖总峰面积的变化, 结果表明, 当三乙胺浓度为0. 20%时, 总峰面积最大。随着浓度的不断增加, 峰面积反而减小, 原因可能是碱性增强, 加快衍生化试剂的分解, 从而使衍生化效率降低, 所以选择三乙胺浓度为0. 20%。2. 3. 4 反应温度的考察 采用不同的水浴温度来考察衍生化反应温度的影响, 结果表明, 当反应温度为60 , 总峰面积变化不明显, 说明衍生化反应已基本稳定, 故选择反应温度为60 。. 5 结果851 医药导报2008年7月第27卷第7期表明, 当反应时间为30m in , 总峰面积变化不明显, 说明衍生化反应已基本稳定, 故选择反应时间为30m i n 。2. 4 系统适应性实验 采用上述条件进行对照品溶液的分析, 氨基葡萄糖两个异构体之间的分离度均>2. 5, 两个峰的理论塔板数均>9000, 拖尾因子均<1. 2。取对照品溶液连续进样5次, 其峰面积的RSD 为0. 3%。2. 5 方法学验证2. 5. 1 线性关系考察 分别配制浓度为0. 4, 1. 0, 1. 6, 2. 0, 2. 4, 3. 0mg mL -1的对照品溶液, 按上述方法进行衍生化反应, 得到的溶液分别取20 L 进样, 以峰面积(Y 为纵坐标, 对照品浓度(X 为横坐标进行线性回归, 得到回归方程为:Y =1. 980 106X -5. 941, r =0. 9997, 氨基葡萄糖在0. 43. 0m g mL -1范围内呈良好的线性关系。2. 5. 2 专属性 取阴性空白溶液进样分析, 结果在与对照品主峰保留时间相同的位置上无色谱峰出现, 另取氨基葡萄糖片剂和胶囊溶液进样分析, 其色谱图中辅料对主峰也没有干扰, 主峰的峰纯度符合要求, 证明此方法具有良好的专属性。在上述色谱条件下, 氨基葡萄糖的两个异构体及过量的衍生化试剂都能得到良好的分离。2. 5. 3 重复性实验 分别配制氨基葡萄糖盐酸盐、氨基葡萄糖硫酸盐、氨基葡萄糖盐酸盐片剂、氨基葡萄糖硫酸盐胶囊供试品溶液(均相当于氨基葡萄糖盐酸盐2. 0mg mL -1 各6份, 按上述方法处理后分别进样, 测定含量, 计算的RSD 分别为0. 5%, 0. 8%, 0. 5%, 0. 5%。2. 5. 4 中间精密度 由两名分析者分别3d 进行测定, 每天配制 2. 5. 3 项下4种供试品溶液各1份, 分别进样分析, 测定含量, 结果4个样品的RSD 分别为1. 5%, 1. 6%, 1. 4%, 1. 3%。2. 5. 5 回收率实验 分别称取适量的氨基葡萄糖原料(盐酸盐、硫酸盐 、氨基葡萄糖制剂(盐酸盐片、硫酸盐胶囊 的供试品各9份, 置50mL 量瓶中, 分别加入低(1. 0m g mL -1 、中(2. 0mg mL -1 、高(3. 0m g mL -1 浓度的氨基葡萄糖盐酸盐对照品各3份, 配制成供试品溶液, 再按上述方法进行测定, 测得氨基葡萄糖盐酸盐、氨基葡萄糖硫酸盐、氨基葡萄糖盐酸盐片、氨基葡萄糖硫酸盐胶囊的回收率结果见表1。 表1 分析方法的回收率%, s加样浓度/(m g mL -1氨基葡萄糖原料盐酸盐硫酸盐氨基葡萄糖制剂盐酸盐片硫酸盐胶囊1. 099. 3 0. 399. 2 1. 098. 1 1. 199. 5 1. 42. 0100. 6 0. 4100. 4 0. 599. 3 0. 499. 9 0. 13. 0100. 5 0. 2100. 2 0. 8100. 5 0. 4100. 7 0. 92. 5. 6 稳定性实验 按 2. 5. 3 项下的方法分别测定4种供试品的衍生物溶液各1份, 分别间隔0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 24h 后进样, 考察氨基葡萄糖总峰面积的变化, 4种供试品溶液峰面积的RSD 分别为0. 3%, 0. 3%, 0. 4%, 0. 4%, 结果表明4种供试品衍生物溶液在24h 内均很稳定。2. 5. 7 耐用性实验2. 5. 7. 1 色谱柱 实验中分别用岛津Sh i m -pack VP-ODS C 18柱(250mm 4. 6mm , 5 m 、W aters Symm etry C 18柱(150mm 4. mm, g 8(2504. 6mm, 5m 进行分析, 由于品牌、固定相类型、柱长及新旧程度不同, 分离效果也不相同, 但通过调整流动相比例均可达到理想的分离效果, 尤其是岛津Sh i m -pack V P -OD S C 18柱效果最好, 故本研究选择该柱进行测定。2. 5. 7. 2 色谱仪 实验中分别用W aters2695液相色谱仪和A g ilent 1100液相色谱仪进行测定, 分离度和柱效均符合要求, 均能得到理想的结测定果。2. 5. 7. 3 流动相比例及pH 值 实验中, 采用乙腈-磷酸盐缓冲液比例分别为(35 65 、(40 60 和(45 55 的流动相以及磷酸盐p H 分别为2. 2, 2. 5和2. 8的流动相进行分析考察, 结果均能得到良好的分离效果。2. 6 样品含量测定 分别取氨基葡萄糖盐酸盐、氨基葡萄糖硫酸盐、氨基葡萄糖盐酸盐片、氨基葡萄糖硫酸盐胶囊样品2份, 按上述方法进行测定, 含量结果分别为100. 8%, 99. 9%, 102. 6%, 99. 7%。3 讨论氨基葡萄糖盐酸盐存在两个天然异构体, 刚溶于水时其比旋光度值最高, 随着时间的延长, 其比旋光度迅速下降。约2h 后, 比旋光度趋于稳定, 稳定的氨基葡萄糖盐酸盐水溶液是 型和 型的平衡混合物7。氨基葡萄糖水溶液经衍生化后, 在色谱图中出现两个峰, 这两个峰经二极管阵列检测器扫描后, 发现具有相同的光谱图, 因而笔者认为这两个峰是氨基葡萄糖的两个异构体峰。所以本研究按两个峰的总峰面积进行定量分析。氨基葡萄糖盐酸盐以及其他盐类的含量测定方法在 美国药典 第27, 28及29版中都有收载, 其采用的是H PLC 直接测定法6, 在195n m 波长处检测, 只有一个色谱峰。笔者研究发现, 该方法存在很大的缺陷, 首先是精密度差, 溶液不稳定, 而且利用盐酸氨基葡萄糖对照品进行硫酸氨基葡萄糖的含量测定时, 结果明显偏高。氨基葡萄糖本身没有紫外吸收, 在195n m 末段波长处测定干扰比较大, 本研究采用衍生化方法进行测定, 在265n m 处对衍生物进行检测, 无论是氨基葡萄糖盐酸盐、氨基葡萄糖硫酸盐原料药还是其制剂的含量测定, 供试品溶液在24h 内均较稳定, 而且精密度好, 准确性高, 结果理想。参考文献1 ANDERSON JW. G l ucosa m i n e effects i n hum ans :a revie w of eff ectson gl u cos e m etaboli s m, s i de effects , s afet y cons i derati on s and efficacy J.F ood Che m T o x ic ol , 2005, 43:187-201.2 陈金东, 李 蔚. 滴定分析法和分光光度法测定保健食品中D-氨基葡萄糖盐酸盐含量的研究J.中国卫生检验杂志, 2002, 12(2:143-144.3 王 维, 尤瑜敏, 周培根. D -氨基葡萄糖测定方法的比较J.食品研究与开发, 2003, 24(2:84-87.4 冉 兰, 张 榕, 文 霞, 等. 比色法测定盐酸氨基葡萄糖片的含量J.华西药学杂志, 2001, 16(3:217-218.5 杨 澜, 李铜铃, 黄 婷, 等. RP -HPLC 测定盐酸氨基葡萄糖片的含量J.华西药学杂志, 2005, 20(3:259-260. 6 USP29-NF24Z.2341-2343.7 周培根, 尤瑜敏, 戚晓玉. 氨基葡萄糖盐酸盐的制备及其某些性质J.水产学报, 2000, 24(1:76-80.852 H erald ofM ed icine Vo l 27No 7July 2008-