真核生物基因组DNA的提取和含量测定.doc

【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流真核生物基因组DNA的提取和含量测定.精品文档.专业： 药学 姓名： 阿卜杜合力力 学号： 3100105256 日期： 2012.5.10 地点： 生化实验室 装 订 线实验报告课程名称： 生物化学实验 实验名称： 真核生物基因组DNA的提取和含量测定 指导老师： 同组学生姓名： 廖杰 成绩：_真核生物基因组DNA的提取和含量测定【实验原理】制备具有生物活性的大分子核酸，必需采取温和的制备条件，避免过酸、过碱的反应环境和剧烈的搅拌，防止核酸酶的作用，并要求在低温下进行操作 。一、 真核生物基因组DNA的提取本实验选用小鼠肝脏细胞作为实验材料，采用匀浆法破碎组织细胞。DNP在0.14mol/L NaCl中不溶解,而RNP可溶解。用无菌水溶解沉淀，加入蛋白酶消化液（含有蛋白酶K和SDS）。温和方法的破碎细胞而不产生机械剪切以致破坏DNA的完整性，可以变性Dnase，还可以去除部分的蛋白。使核蛋白体从DNA上解离。 然后加RNase以去除RNA，再用苯酚:氯仿抽提法反复抽提提取DNA苯酚:氯仿抽提法： 酚、氯仿是有机溶剂，能有效地使蛋白质变性。纯酚在与水混合时处于下层。然而有机相和水相会难于分开。若使用酚：氯仿混合物抽提，由于氯仿的比重较大(1.47)，可在很大程度上解决这个问题，促进两相的分离。异戊醇则可减少操作过程中产生的气泡。变性蛋白一般集中在两相之间的界面层，而脂类则有效地分配在有机相中，核酸则被留于上层水相。该法其具有操作条件比较温和，能迅速使蛋白质变性并同时抑制核酸酶的活性，可得到具有生物活性的高聚合度的核酸等优点。 但其操作步骤较为繁琐，去除蛋白质需要反复进行多次。 砷盐、氟化物、柠檬酸、EDTA等可抑制DNase的活性；皂土等可抑制RNase的活性。收集上清液后用乙醇沉淀DNA，最后用TE缓冲液溶解DNA，并用紫外吸收法测定DNA的含量及纯度。二、 紫外吸收法测定基因组DNA的含量及纯度1紫外分光光度法测定核酸含量：由于DNA在260nm处有最大的吸收峰，因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，吸光度A值为1相当于大约50g /ml双链DNA。2紫外分光光度法测定DNA纯度：由于DNA在260nm处有最大的吸收峰，而蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，DNA纯品的算A260/ A280为1.8（1.71.9），故根据算A260/ A280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。三，二苯胺显色法测定DNA含量DNA在酸性条件下加热，酸解释出脱氧核糖。脱氧核糖在酸性环境中脱水生成-羟基-酮基戊醛，后者与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应，在595 nm处有最大吸收。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。除脱氧核糖外，脱氧木糖、阿拉伯糖也有同样反应。其他多数糖类，包括核糖在内，一般无此反应。【操作与步骤】一、 基因组DNA的提取1组织细胞的裂解 （1）切取0.2g鼠肝，冰冷生理盐水洗3次。当组织离开机体，DNA酶就会表现出活性。在冰冷的生理盐水中，可以降低DNA酶的活性，防止基因组DNA被降解。（2）碎鼠肝转入玻璃匀浆器中，加入2mL分离缓冲液，匀浆（冰上操作）。（3）匀浆液转入2mL离心管，4 , 5000rpm离心5min；沉淀加0.4mL无菌水，吹散后再加0.4mL的蛋白酶消化液（含100g/ml的蛋白酶K），慢慢颠倒混匀，50保温90分钟, 直到组织完全解体。（4）加10mg/ml的RNase 16l (终浓度200g/ml)，37保温40min。2裂解物中蛋白质的去除 （1）加等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，慢慢颠倒混匀，冰上静置5min。待分层后, 于4，12000rpm离心15min。离心后可见分层，上层为水相含DNA，下层为有机溶剂层，变性蛋白质介于两层之间。（2）小心吸出上面的水层并转移到新的小离心管中，根据吸出的量再加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，重复上述操作以去除蛋白质，直至界面不再出现明显的变性蛋白质为止。（3）小心吸出上面的水层并转移到另一新的小离心管中，根据吸出的量再加入等体积氯仿/异戊醇，慢慢颠倒混匀。4，12000rpm离心15min。本步骤可去除微量的酚。3DNA的沉淀 (1)上清加1/10体积的3mol/L NaAc(pH 5.2)和2倍体积的无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静止10分钟，DNA沉淀形成白色絮状物。10000rpm离心10min，弃上清。(2)DNA沉淀溶解于3ml TE 中，进行260nm/280nm紫外检测。二、 紫外吸收法测定基因组DNA的含量及纯度1用TE缓冲液稀释样品（520倍），2用TE缓冲液调零点，样品稀释液转入紫外分光光度计的石英比色杯中，分别测定其在260nm和280nm的吸光度。吸光度在0.21.2 OD范围内较为理想。3计算浓度： 双链DNA样品浓度(g/l) =A260×核酸稀释倍数× 50/10004计算A260/ A280比值，分析纯度。三、 二苯胺显色法测定DNA含量1. DNA标准曲线的制定 取10支试管，分成组，依次加入0.4、0.8、1.2、1.6和2.0 mL DNA标准溶液。添加蒸馏水，使每管体积为2 mL。 另取2支试管，各加2 mL蒸馏水作为对照。 然后各加入4 mL二苯胺试剂，混匀。 于100恒温水浴中保温20分钟，冷却后于595 nm处进行比色测定。 取两管平均值，以DNA含量为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。 2. 制品的测定 取2支试管，各加2 mL待测液(内含DNA应在标准曲线的可测范围之内)和4 mL二苯胺试剂，摇匀。其余操作同标准曲线的制作。 3. DNA含量的计算 根据测得的光吸收值，从标准曲线上查出相当该光吸收值的DNA的含量。【实验结果】一、纯度测定结果：三、 含量的计算：标准曲线数据DNA含量（mg/L）013.3 26.64053.366.6吸光的(=595nm)00.1880.2750.3550.4380.528样品DNA的A595=0.284从DNA标准曲线可得到样品DNA的含量为33.81mg/mL 。【分析与讨论】抽提DNA 去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好?A1: 酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变 性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。作为表面变性剂的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10%-15%的水溶解在酚相中，因而损 失了这部分水相中的DNA ，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA 。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带 走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿1:1混合使用。Q2：为什么用酚与氯仿抽提DNA 时，还要加少量的异戊醇?A2：在抽提DNA 时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中 的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊醇的比例为24:1。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25:24:1，同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变 性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。