实验四--蛋白质纯化---盐析沉淀法.doc

Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-date实验四-蛋白质纯化-盐析沉淀法实验四 蛋白质纯化 盐析沉淀法实验四 蛋白质纯化 盐析沉淀法【实验目的】采用硫酸铵盐析法将日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶融合蛋白从大肠杆菌BL21（DE3）pGEX-NS53细胞裂解液中分离出来，使学生学习掌握制备细胞裂解液的技术和采用盐析法从中分离目的蛋白质的技术。【实验原理】用盐析法从成分复杂的蛋白质溶液（如细胞裂解液）中提取目的蛋白质是一种传统的目前仍被广泛使用的蛋白质分离纯化技术。此种技术的工作原理如下：蛋白质在稀盐溶液中，其溶解度会随盐浓度的升高而增加，此种现象被称作盐溶。但是当盐的浓度继续增高时，蛋白质的溶解度又以不同程度地下降并先后从溶液中析出，此种现象被称为盐析。上述现象 是由于蛋白质分子中极性基团之间存在静电力。在低盐浓度下，蛋白质分子中极性基团之间的静电力受盐离子的影响而被消除，蛋白质在水中的极性基团的电荷被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质分子之间相互聚集并从溶液中析出。盐析法就是根据不同蛋白质在一定浓度的盐溶液中溶解度降低程度的不同而达到彼此分离的方法。 盐析的一般操作步骤是，选择一定浓度范围的盐溶液（如0-25%饱和度的硫酸铵）使部分杂质呈“盐析”状态从溶液中沉淀出来，经离心法去除。而目的蛋白质呈盐溶状态，存在于上清中。增加盐浓度（如25-60%饱和度的NH4SO4）使目的蛋白质呈盐析状态，而从溶液中分离出来。在盐析时，蛋白质的溶解度与溶液中离子强度的关系，可用下式表示： Slg = -Ks×I S0式中的S为蛋白质在离子强度为I的溶解度，S0蛋白质在纯水（离强度为0）中的溶解度；KS为盐析常数。离子强度I可用下式表示：I=1/2Z2式中，M-溶液中各种离子克分子浓度 Z-各种离子所带的电荷数在温度恒定时，S0对于某一种蛋白质在某一溶液中的溶解度是一个常数，lgS0也为一常数，以代替，故式（1）可以改写为：lgS=b-Ks×I （3）值主要与蛋白质的结构，盐离子的平均半径以及盐离子的电荷数有关，也受溶液中的氢离子浓度（PH值）和温度影响。一般来说，蛋白质在某一盐溶液中的盐析系数-KS越大，盐析效果越好。由于蛋白质含有许多亲水基团，需要在较高的I植下才能从溶液中析出。由式（3）可以看出，在一定的温度和PH值下，改变盐的离子强度（I）可以把不同的蛋白质从溶液中沉淀出来。此种方法称为“KS分段盐析法”,常用于蛋白质的初步提纯。在一定的的I值下，改变温度及PH值，使蛋白质从溶液中沉淀出来，称为“分段盐析法”，常用蛋白质纯化过程的后期，特别是某些蛋白质结晶析出时。蛋白质盐析常用硫酸铵等中性盐。硫酸铵因其溶解度大（25时的饱和硫酸铵溶液的摩尔浓度为4.1M，即767克/升，0时为3.9M，676克/升），温度系数小而被广泛使用。硫酸铵价格便宜，不易引起蛋白质变性并具有稳定蛋白质的作用，分段效果比其他盐类好，废液可以作肥料，对环境无污染。其缺点是，其NH+4对用凯氏定氮测定蛋白质含量有干扰，硫酸铵溶液的PH常在4.5-5.5之间,其缓冲能力比较差。有时用硫酸钠.。蛋白质盐析时,盐的浓度一般以饱和度表示，饱和溶液的饱和度定为100%。用硫酸铵盐析时，溶液饱和度调度方法有三种，一是当蛋白质溶液体积不大，需调正的浓度不高时，可以向蛋白质溶液中添加饱和盐溶液。另一种方法是向蛋白质溶液中直接添加磨碎的盐结晶粉末，此种方法用于需要的盐浓度高，而且蛋白质溶液体积不宜过分增加时。第三种方法是将待盐析蛋白质的溶液装于透析装内对饱和硫酸铵进行透析，此法盐浓度变化比较连续平稳，不会出现局部过高现象。但是盐析时需要测定盐的饱和度，过程复杂，较少应用。采用方法一时，所需添加的饱和盐溶液的体积可按下式计算： S2-S1V=V0 1-S2式中，V饱和盐溶液的体积 V0原溶液的体积 S1原溶液的饱和度 S2要达到的饱和度采用第二种方法时，可从附表一中选择要达到某一浓度时所需添加的固体硫酸铵量。影响蛋白质盐析的因素：（1）蛋白质溶液中盐的浓度。不同蛋白质的盐析要求盐的饱和度不同。从成分复杂的蛋白质溶液中分离蛋白质时，盐的饱和度应由稀到浓渐次增加。每出现一种蛋白质沉淀就应将其分离除去后，再继续增加盐的饱和度，使第二种蛋白质沉淀出来；（2）蛋白质溶液的PH值。在蛋白质的等电点时，蛋白质的溶解度最小而容易沉淀出来，因此盐析时应将PH值调节在目的蛋白质的等电点附近；（3）蛋白质浓度。在相同盐析条件下，蛋白质浓度越大越易被盐析沉淀。但是浓度太高时，易使杂蛋白共沉淀；（4）温度。浓盐溶液对蛋白质有一定的保护作用，因此一般的盐析操作可以在室温下进行。【实验器材】 100ml烧杯，50ml离心管，高速冷冻离心机,微量离心管(1.5ml)10支,聚丙烯酰胺凝胶电泳仪一台,1ml,200l,20l移液器各1把,1ml,200l和20l枪各1支,微量离心管支架,磁力搅拌器及搅拌磁棒。【实验材料】1大肠杆菌BL21（DE3）pGEXNS53细胞裂解液，由上一实验提供2分析纯硫酸铵：用干净的磁研钵研成细粉末。330%三氯乙酸4SDS-PAGE所需试剂【实验方法】1 盐析曲线的测定对于一求知盐析特性的蛋白质来说，用盐析作为一纯化步骤时，应首先用实验确定使此种蛋白质盐析沉淀出来的最佳饱和度，其测定方法如下： （1）取7支微量离心管，用记号笔在管帽上标记20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%；（2）以上述离心管作容器分别称取磨细的硫酸铵晶体末0.057克、0.088克、0.122克、0.156克、0159克、0.235克和0.281克；（3）分别向上述装有（NH4）2SO4粉末的离心管中添加0.5ml细胞裂解液，充分振荡使（NH4）2SO4溶解后，在室温下静置2小时；（4）将离心管放置于离心机中，以1000转/分转速离心5分钟后，倾去上清，倒立离心管，以便尽可能多地去除上清；（5）添加0.5ml蒸馏水及8l30%三氯乙酸混匀,静置10分钟后,离心,尽量去除上清；(因此步会造成蛋白质不溶影响后续工作，所以省略)（6）将离心管置于快速干燥器中干燥30分钟；（7）向离心管中添加100ISDS-PAGE上样缓冲液悬浮沉淀后，在沸水浴中煮沸3分钟，取出置-20冰箱中备用；（8）制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶；按下列上样顺序向加样孔中添加10l 样品：样孔 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10包涵体样20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 包涵体 空白对照电泳分离后，染色、脱色、观察目的蛋白质出现在何种浓度的（NH4）2SO4盐析样孔中，以确定最佳的盐析条件。2盐析（1）将50ml细胞裂解液置于100ml烧杯中，加入搅拌磁棒后放置在磁力搅拌器上（2）在搅拌状态下缓缓加入研细的（NH4）2SO4末至最佳饱和度之前的一级饱和度，静置2小时后,离心得上清（3）在搅拌下向上清中添加研细的（NH4）2SO4粉末，使终浓度达最佳饱和度，静置2小时后离心收集目的蛋白沉淀（4）将沉淀的蛋白质溶解于尽量小体积的磷酸盐缓冲的生理盐水中，用Bradford试剂测定蛋白质浓度后，置-20冰箱中保存备用。【思考题】 1. 为提高蛋白质盐析分离效率，应采取哪些措施？2为测定用硫酸铵盐析法分离某种蛋白质的最佳硫酸铵浓度，除采用本讲义设计的操作程序之外，请你设计另一种工作程序测定盐析目的蛋白质的硫酸铵最佳浓度，并指出两种方法的优缺点。3请你计算25时60%饱和度的硫酸铵溶液的离子强度。-