贻贝足粘蛋白研究进展.doc

【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流贻贝足粘蛋白研究进展.精品文档.贻贝足粘蛋白研究进展吕玉伟 王睿劼 王英娟 （西北大学生命科学学院;陕西省生物技术重点实验室，西安 710069）摘要 贻贝足粘蛋白是由贻贝类腹足附近的足腺合成并分泌到足丝的一类特殊的粘性蛋白质,能够在水下迅速固化形成具有粘附能力的附着基，具有生物降解的特性、生物相容性好，无毒、无害、无免疫原性，具有合成胶所不具有的特点，一直是粘合剂领域的研究热点。目前对贻贝足粘蛋白的研究有很多，通过对现有文献的检索，概述了贻贝足粘蛋白质的氨基酸组成、结构、基因表达、获取方法、粘附机理及应用等方面的研究进展，为贻贝足粘蛋白的进一步研究提供参考资料。关键词 足粘蛋白；粘附机理；Mefp基因；多巴；获取方法中图分类号Research progress of Mytilus Edulis Foot ProteinLV Yuwei ,WANG Ruijie ,WANG Yingjuan（College of Life Sciences,Northwest University, Xian 710069,China）Abstract：Mytilus edulis foot protein which is synthesised by Mussels foot gland can rapidly be solidified under water to attache with adhesive ability and it has the nature of biodegradation, biocompatibility, nontoxic , harmless and no immunogenicity. In addition ,the nature do not have in synthetic rubber. Because its excellent adhesive bonding characteristics ,Mytilus edulis foot protein has been a hot research field. The retrieval of the existing literature on the types of mussel adhesive protein, amino acid composition and structure, genetic expression, adhesion mechanism and genetic engineering research provide scientific information for further study on mussel adhesive protein. Key words: Mefp ; Adhesion Mechanism ; Mefp gene; DOPA ; Gain 贻贝是双壳类软体动物，俗称海虹和青口，可在水环境中牢固地黏附于各种不同材料表面，其足丝中起黏附作用的物质已被证明是各种贻贝足粘蛋白。贻贝足粘蛋白（Mytilus edulis foot protein, Mefp）是由贻贝类腹足附近的足腺合成并泌到足丝的一类特殊的粘性蛋白质，是足丝的主要成分，又称多酚蛋白质或贻贝粘附蛋白质1-4。Mefp粘合强度高，能在水下迅速凝固成有黏附能力的附着基，呈生物惰性并具有生物降解的特性，生物相容性好，对人体无毒、无害、无免疫原性，具有合成胶水所不具有的特殊优势，可作为生物粘合剂广泛用于软组织黏接、人造骨骼断骨接合、口腔修复以及眼科手术等，有可能成为今后医用粘合剂研究的主流。本文就目前国内外Mefp的开发研究及临床应用概况作简要介绍。1 Mefp的氨基酸组成及结构随着Mefp的氨基酸组成序列及结构的研究，已经知道Mefp分子量约为l30KD，为碱性多酚蛋白质，富含Pro/hyPro、Ser、Thr、Lys、Tyr、Ala以及多巴（3,4-二羟基苯丙氨酸，DOPA），羟基化和氟基化后的脯氨酸残基有利于蛋白的正确折叠并且赋予粘蛋白更好的黏附性能5。Mefp的一级结构由75-80个多肽片段重复构成，多肽片段类型有A、B、B'、C、D、E 6种。其中，E型最为常见是十肽片段（-Ala-Lys-Pro-Ser- Tyr-Hyp-Hyp-Thr-hyPhe-Lys-）；B、C、D型与E型类似，均为十肽片段，差异仅在个别氨基酸残基，B型的第3和第5位分别为Hyp和hyPhe，C型的第5位则是hyPhe，D型的第3位为Hyp；A型、B'型不同于E型，为六肽片段，其中A型肽段为-Ala-Lys-Pro-Thr-hyPhe-Lys-，B'型肽段为-Ala-Lys-Pro-Thr-Tyr-Lys-，二者仅是第5位的氨基酸残基不同。研究发现Mefp的糖基化和羟基化程度均非常高，肽链之间交联紧密形成二级结构，其中富含hyPhe，结构异常复杂6。2 Mefp家族及主要家族的表达目前多以紫贻贝为材料开展Mefp研究。紫贻贝中至少有8种足丝蛋白，分别为Mefp1Mefp6、preCoID和preCoING，其中胶原蛋白preCoID和preCoING主要构成贻贝足丝蛋白的核心骨架并延伸至足丝盘7；Mefp-1分布于的整个足丝表面而构成足丝的保护外套，以防止海水的溶解及微生物的降解；Mefp2Mefp6主要位于贻贝的足丝盘，是贻贝的足丝与外界固体表面形成黏附的主要成分。随着对于Mefp家族的基因表达研究的升温，Genex公司率先用贻贝酚腺中mRNA建立了蛋白质数据库，并鉴定出贻贝足蛋白质的氨基酸残基为十肽和六肽的交替排列形式。该公司通过mRNA，创建多酚蛋白质的cDNA文库，构建大肠杆菌穿梭质粒,在酵母中进行Mefp的基因表达研究，证明重组外源基因Mefp可以在宿主中稳定、良好地表达出Mefp。 Mefp-1由80个E型十肽串联重复的组成，分子量约为108KD，是Mefp中最大的蛋白，主要分布在足丝和附着基外表面的涂层中，DOPA的含量约为11，通过与苯醌发生交联反应和与Fe（III）发生金属络合反应，形成致密和坚韧的涂层，保护足丝的降解。Mefp-1基因重组后，尝试在大肠杆菌、酵母体系中进行表达，但是由于Mefp-1自身的特性，大约80个串联的十肽重复序列导致质粒不稳定，从而影响翻译过程，在二宿主很难获得成功表达。 Mefp-2的分子量为45KD，在Mefp中约含40，含量最高，富含胱氨酸和DOPA（约5%）、含有11个串联的表皮生长因子（EGF）的重复单元，是附着基的主要成分，与粘蛋白之间的共价交联有关8。利用Mefp-2基因构建转化载体，转化巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris，Gs115），经过筛选阳性转化株后，通过与野生型对比的组氨酸检测及分子生物学PCR检测，获得Mefp-2基因重组酵母菌株Gs115/mefp21，重组菌株可以经过甲醇诱导和发酵培养9。Mefp-3的分子量为5-7KD，无重复单元，在Mefp中含量最少,但DOPA的含量高达28%，主要分布在基底面和外界接触的界面处，含有Arg，Arg被修饰成4-羟基-L-精氨酸（R）后能以-键、库伦相互作用、H-键在金属表面形成有机金属络合物而粘到物体表面。重组Mefp-3基因的A型基因Mefp-3A,，在大肠杆菌中表达出的Mefp-3A蛋白质分子量为7KD2，最近李楠楠等10将Mefp-3基因转入到大肠杆菌，Mefp-3蛋白主要以包涵体的形式得到了表达。Mefp-4的分子量约为90KD，有多种高度重复序列，富含有大量的His、Lys、Arg及Asp，其中His为22%，但DOPA的含量仅为2%。与Mefp-2一样分布在附着基上，Mefp-4可能与足丝纤维中的胶原蛋白相连接，同时在足蛋白分子之间的交连发挥作用11。尚未见到基因工程方面的研究资料。Mefp-5的分子量为9KD，有76个氨基酸，每四个氨基酸中就会有超过1个的DOPA，总含量为30%。与Mefp-3一样，Mefp-5分布于基底面和外界接触的界面处。序列中超过1/3的残基经羟基化和磷酸化（Ser）修饰，具有强粘合力。 Hwang等从cDNA中克隆的Mefp-5构建了含有His6、IPTG诱导启动子标签的大肠杆菌表达载体，借助原核表达系统成功表达得到重组Mefp-5蛋白质12。Mefp-6的分子量为11.6KD，其中序列中含量最丰富的是Try(20%),其次是Gly(14%),Cys为（11%），但DOPA的含量不到5%。有1/3的Cys保留了自由的巯基，介导足丝盘和黏附蛋白中的DOPA之间形成交联结构，且发现了多种天然变异体13，鲜见其基因表达研究资料。3 Mefp的获取方法 天然的Mefp制成细胞或者组织培养用的粘合剂产品“Cell-Tak”,主要是Mefp-1、Mefp-2和Mefp-3的混合物，可以使细胞或者组织粘附在塑料、玻璃、金属和各种生物材料等各种材料表面。现阶段从天然贻贝中提取纯化Mefp是获得该粘合蛋白的主要途径，也是最直接的方法，但是由于贻贝足丝蛋白的分泌量极低，一万个贻贝仅能得到1mg的粘蛋白，所以价格昂贵。有研究通过体外培养足腺细胞来制备粘蛋白，这样不仅能够制备高粘度的蛋白，而且也有利于研究分泌调控的机制，但是由于无脊椎动物细胞普遍存在培养难、成本高等问题，目前足腺细胞的体外培养及建系尚未成功14。研究者尝试利用基因工程的方法生产贻贝足粘蛋白，取得了一定的进展，但是不能完全解决Mefp来源难题。大肠杆菌中表达出的重组蛋白质Mefp-3A，亲和层析纯化纯度达99%，产率为18%，在5%醋酸缓冲液中的溶解度好，粘性与已经商业化的贻贝粘蛋白质Cell-Tak相当2；借助大肠杆菌表达的重组蛋白Mefp-3，亲和层析后纯度约98%，但黏附性能仅为天然提取的一半10，可能是天然的粘蛋白在贻贝足腺细胞中被合成时经历了复杂的羟基化、磷酸化、糖基化及交联反应，与原核生物的修饰不同导致其粘附性差异。原核表达的重组蛋白质Mefp-5，含量为40 mg/L，占可溶性总蛋白质的10%，亲和层析纯化后纯度可达95%，但由于其粘附于层析柱上，回收率仅为7%，而且重组Mefp-5基因表达后几小时，表达速率下降至几乎停止，之后大肠杆菌细胞恢复生长，同时伴随着重组Mefp-5蛋白质的轻微降解12。4 Mefp的粘附机理 Mefp的粘附机理一直是贻贝粘蛋白的热点研究领域，目前认为Mefp的强粘合力与其氨基酸残基密切相关，其中最关键的是酪氨酸经羟基化修饰的DOPA残基，DOPA能与蛋白质等极性聚合物间形成很强的氢键，并且DOPA的苯酚基团有很强的金属络合力，可以在材料表面形成不可逆的有机金属络合物。Qi Lin等15发现在云母的Mefp (Mefp-1&3)中含有10-20%的DOPA，对其的粘附力至关重要，除去粘附界面DOPA残基后，其粘着力显著下降16-17；在Mefp-5中DOPA的含量约占30%（含量最高），拥有粘附能力达到Ead= -14mJ/m2，超过了任何一种相互作用的粘蛋白18。研究认为Mefp-3和Mefp-5在水环境中能够保持较佳的粘附力，是因为DOPA中的酚羟基以供/受H体与金属表面形成形成氢键，强度远大于水与金属表面形成的氢键19，此外残基中磷酸化Ser的O-磷酸丝氨酸对钙的亲和力很强，与金属表面相接触时，磷酸基团的负电荷与金属离子相互作用，可以提高粘附性能20。另外Mefp-1及Mefp-1中含DOPA的多肽，能与Fe3+在20、pH10的条件下形成稳定的三价铁络合物（稳定常数超过1040），以此增强Mefp粘合力；此外DOPA残基与其他芳香基之间存在-非共价键，也能增加Mefp的粘附性21。Mefp增加内聚力最主要、最常见的是di-DOPA内部共价交联。研究发现Mefp-2和Mefp-4的DOPA易被氧化，形成的DOPA醌通过Schiff base(希夫碱)和Mickeal加成反应，与Lys和Cys之间交叉结合可以产生di-DOPA22，生长中的天然贻贝也可以检测到用同位素13C和2H的标记Tyr所产生的di-DOPA，di-DOPA产生共价交联增加Mefp的内聚力，提高粘附性。NaIO4对Mefp的吸附作用也有积极地影响23，同时光谱学分析在ZnSe的表面上由NaIO4和Cu2+所介导Mefp-1的相互交联，NaIO4作用类似于儿茶酚氧化酶，有助于di-DOPA的共价交联24-25。5 Mefp的应用 Mefp在可以排开粘合面的水，呈生物惰性，实现水中快速固化；形成的固化膜透明、透气、强度高、韧性好，可以作为一种湿性粘合剂用于防水、防腐和粘接；Mefp在人体内不易引起机体产生免疫反应，可以生物降解，生物相容性较好，具有光谱胶粘性，可以作为一种理想的医用粘合剂。5.1 细胞培养和组织工程Mefp生物相容性好，可以作为细胞和组织培养液的添加剂，促进细胞贴壁生长；也可用于组织工程中人造器官构建，促进细胞与支持物粘附。目前使用的贻贝产品“Cell-Tak”能使细胞或者组织粘附在塑料、玻璃、金属等各种材料表面，可以简化原位杂交、免疫组化和原代细胞培养等各种技术中的生物学样本的操作。有研究发现Mefp-5可以在玻片上有效固定活的非帖壁依赖性细胞昆虫的DrosophilaS2和人的MOLT-4，固定状态中，非帖壁依赖性细胞可以经历1周的正常分裂，无细胞学变异。也有研究在涂有fp-151-RGD的表面上，细胞的凋亡能够被很明显的抑制，分析可能由于RGD引发的整联蛋白所介导的信号通路的激活，促进了细胞的增殖、扩散，提高了存活率，该研究使fp-151-RGD处理培养器械在细胞培养中成为可能26。5.2 防腐Mefp作为一种生物防腐剂和粘合剂，用于船舶、潜艇、海水养殖设备的防水、防腐和防止海洋生物的附着，不会损害人们的健康和生态系统。由带正电荷的Mefp-1和带负电荷的二氧化铈纳米颗粒在碳素钢和二氧化硅的表面经过层层沉淀复合形成的具有黏着力的薄胶片，不仅能够抵制解吸附作用27-28并且随着Mefp-1浓度的增加其耐磨性和防腐能力也会大大增强29-30；此外由于NaIO4能够增强Mefp的共价交联，所以通过NaIO4的氧化后在碳素钢的表面由Mefp形成的薄层其保护效率增强多达80%，进一步的提高防腐性能25,31。5.3 临床应用Mefp可形成透明透气防水有弹性的保护膜，具有和眼角膜近似的折射率，不干扰光线到达视网膜，无化学刺激无催泪反应，粘接能力和寿命不受水和盐浓度的影响，对眼部组织功能无后期影响，在眼科临床中具有独特优势。 Mefp具有优异的生物相容性，可以与表皮细胞、干细胞、血小板等共存，不导致血管堵塞，也可以保护金属，使金属植入物的寿命更长。Mefp在聚乙二醇的作用下嫁接到含有EVA（ethylene vinyl acetate）的表面上后，提高内皮细胞在涂层上的粘着力，促进了内皮细胞膜的融合并阻止了血栓的形成32。以PDA(dopamine-co-acrylate)为前导的粘附剂具有比正常粘附剂高4倍的湿粘着力，在外科手术组织粘附中应用很大33。在金属材料表面（如钛），Mefp和透明质酸发生凝聚作用形成的凝聚层，提高了金属表面的亲水性和表面能，能够促进成骨细胞的增殖34，利用基因工程技术得到重组粘合蛋白材料类似并优于天然粘合剂；当用凝聚层去溶解油滴时，可以形成有黏附性能微胶囊颗粒/微球体，有利于生物体内药物运输20；在相同的条件下与游离的药物相比，由PDA（polydopamine）所运输的阿霉素胶囊体能够增强根除Hela癌细胞的效率，这对用PDA作为药物运输的载体提供了一个新平台35。 Mefp（DOPA）参与CaCO3的矿化作用的形成，氧化了的DOPA不仅能够稳定球霰石的形成，而且能够使球霰石微粒很容易的转变为碳酸化的羟基磷灰石，而碳酸化的羟基磷灰石具有很高的生物再吸收能力， 与天然的骨骼和牙齿相似，对治疗骨缺损和骨退化性疾病有广阔前景36。 此外，Mefp作为生物粘合剂，在肝外胰岛素移植中引发的急/慢性炎症反应最小，有利于切口界面的恢复37；也不会导致闭合后的切口或创口硬化，保持皮肤弹性；能够抑制细菌的生长，但不会对哺乳动物细胞的生存能力产生影响38；用于瘢痕痒感的治疗，缓解彻底、起效迅速、使用简单，无明显不良反应39；具有的反复粘接性，可以在切口或创口闭合过程根据需要中可以进行调整，适合于美容外科切口闭合和外部形态高要求。6 展望 贻贝足粘蛋白具有的湿性粘结性能，黏附强度高，作为天然蛋白质不会对环境造成污染，特有的光谱胶特征、优质的生物安全性和相容性不会损害人体健康，在临床应用中逐渐成为宠儿，成为众多科学家关注的热点。自上世纪80年代以来，人们已经对Mefp及其基因的结构、功能以及相关的黏附机制进行探索，对其应用和开发展开研究，取得了较多的研究成果。目前获得贻贝足粘蛋白的主要依靠天然贻贝提取纯化，随着对贻贝粘附蛋白黏附机理等进行不断的深入研究，有望通过生物技术方法诸如改善细胞培养、基因工程表达方案等，生产出具有黏附强度高、韧性强、耐久性和防水性的优质贻贝生物粘合剂，将获取优质粘蛋白粘合剂的新材料的理想变为现实，应用前景广阔，经济和社会效益显著。参考文献1. 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