食品卫生微生物检验学2.doc

【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流食品卫生微生物检验学2.精品文档.食品卫生微生物检验学刘斌 13055783073 liubin618引言国内外食品安全形势严峻，恶性事件不断发生。欧洲“二噁英”、“疯牛病”（20世纪90年代）日本大肠杆菌O157:H7中毒（1996）中国SARS（2003）东南亚国家禽流感（2004）美国菠菜大肠杆菌O157:H7污染事件（2006）第一章 绪论主要学习内容:1.食品中的微生物2.食品卫生标准的内容3食品微生物检验的意义4.食品微生物检验的范围5.食品卫生标准中的微生物指标第一节、食品中的微生物-来自土壤自然界中微生物的分布极为广泛，水中、高山、海底、荒漠、极地、空气等到处都生存着各种各样、形形色色的微生物。土壤是微生物的天然培养基，它具备微生物正常发育所必须的一切条件：土壤中含有一定的无机物和有机物；土壤中含有适当的水分；大多数中性偏碱,适合大多数微生物生长；土壤中还含有气体，主要是CO2、O2和N2；温度变化不大（10-25）。土壤中含有大量的微生物，土壤中的细菌来自天然生活在土壤中的自养菌和腐物寄生菌以及随动物排泄物及其尸体进入土壤的细菌。土壤中微生物的分布：表层受日光照射和干燥的影响，不利于其生存，所以细菌数量少，离地面10-20厘米土层微生物最多.土层越深，菌数越少。来自水源水也是微生物存在的天然环境，水中的细菌来自土壤、尘埃、污水人畜排泄物及垃圾等。水中微生物及数量因水源不同而异。受到污染的水中含有大量的有机物，适合微生物的生存。静水中的微生物多，流水中的少；离岸近处微生物多，离岸远处少；经过大城市的河流，水受到污染，含有大量的粪便.并含有大量的致病菌。井水和泉水中细菌少，雨水、雪水中也少，城市上空的雨水细菌多，乡村上空雨水细菌少。.国家规定，自来水中，细菌总数每毫升不得超过100个，大肠菌群不得超过3个/升.来自空气在冬春季节，更容易发生感冒等传染病，就是因为空气的传播，特别是在公共场所，人多，空气流通差，细菌多；大城市上空微生物数量最多，乡村少；森林、草地和田野上空空气清洁，海洋、高山冰雪覆盖的地面上空，微生物更为稀少。雨后空气特别新鲜。来自人体人自出生后，外界的微生物就逐渐进入人体。在正常人体皮肤、粘膜及外界相通的各种控道（如口腔、鼻咽腔、肠道和泌尿道）等部位，存在着对人体无害的微生物群，包括细菌、真菌、螺旋体、支原体等。皮肤：表皮葡萄球菌、类白喉杆菌、绿脓杆菌、耻垢杆菌等口腔：球菌（甲型或乙型）、乳酸杆菌、螺旋体、梭形杆菌、白色念球菌、（真菌）表皮葡萄球菌、肺炎球菌、奈瑟氏球菌、类白喉杆菌等胃：正常一般无菌肠道：类杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌、厌氧性链球菌、粪链球菌、葡萄球菌、白色念球菌、乳酸杆菌、变形杆菌、破伤风杆菌、气荚膜杆菌等鼻咽腔：甲型链球菌、奈氏球菌、肺炎球菌、流感杆菌、乙型链球菌、葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、变形杆菌等眼结膜：皮表葡萄球菌、结膜干燥杆菌、类白喉杆菌等微生物引起食品腐败变质食品中含有蛋白质，脂肪，碳水化合物，这些成份是微生物的生长基质，所以微生物在食品中能够生长繁殖。食品腐败变质的原因有物理学、化学、生物化学殖。食品腐败变质的原因有物理学、化学、生物化学和微生物学方面的原因，但最普遍、最主要的因素是微生物。环境中无处不存在微生物，食物在生产、加工、运输、储存销售过程中，很容易被微生物污染。只要温度适宜，微生物就会生长繁殖，分解食物中的营养素，以满足自身需要。这时食物中的蛋白质就被破坏了，食物会发出臭味和酸味，失去了原有的坚韧性和弹性，颜色也会发生变化从而造成食品变质。第二节、食品卫生标准的内容1.感官指标.2.理化指标.3.微生物指标.微生物指标：菌落总数大肠菌群致病菌等第三节、食品微生物检验的意义（一）有害微生物对人类和生产的影响1.引起食品变质.2.引起食物中毒.3.导致人体患病.(二)、食品微生物检验的意义1.是衡量食品卫生质量的重要指标,也是判定被检食品能否食用的科学依据2.可以判断食品加工环境及食品卫生的情况,为卫生管理工作提供科学依据.3.可以有效地防止或减少食物中毒和人畜共患病的发生.4.保证产品的质量,避免不必要的损失.第四节、食品微生物检验的任务及范围任务：通过测定微生物指标，判断食品在加工环境和食品原料及其在加工过程中被微生物污染及生长的情况，为食品环境卫生管理和食品生产管理及某些传染病的防疫措施提供科学依据。范围：1.生产环境的检验2.原辅料的检验3.食品加工、储藏、销售储环节的检验4.食品的检验（重点）第五节、食品卫生标准中的微生物指标 1.菌落总数2.大肠菌群3.致病菌4.霉菌及其毒素5.其他指标一、细菌总数与食品卫生质量评定细菌总数是指在普通营养琼脂培养基上在一定条件下（需氧情况下，36±1，48±2h）培养长出的菌落总数。以1g或1平方厘米表面积或1毫升含有的菌落总数来表示。细菌总数的食品卫生学意义作为食品被污染程度的指标，反映食品的新鲜程度；预测食品的存放期限、食品生产过程中变质与否、食品生产过程中的一般卫生状况。菌落总数：是指在被检样品的单位重量(g)、容积(ml)或表面积(cm2)内，所含能在严格规定的条件下(培养基及其PH、培养温度与时间、计数方法等)培养所生成的细菌集落总数.二、大肠菌群与食品卫生质量评定什么是大肠菌群？是指一群好氧及兼性厌氧、在37、24h能分解乳糖产酸、产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。大肠菌群已被许多国家用作食品卫生质量评价的指标菌。一般认为，大肠菌群都是直接或间接来自人与温血动物的粪便。检测大肠菌群的食品卫生意义：在粪便中的数量最大，可作为粪便污染食品的指示菌。在外界存活期限与肠道致病菌存活期大致相同，可作为肠道致病菌污染食品的指示菌。检验技术要求不高。 大肠菌群目前该项指标已被广泛应用于食品生产中卫生质量方面的指标菌，其数量是采用相当于100g或100ml食品中的可能数来表示，或称大肠菌群最近似数(Maximun Probable N umber,MPN)。大肠菌数的高低，表明粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。典型大肠杆菌代表粪便的近期污染，非典型的可能为粪便的陈旧污染。三、致病菌与食品卫生质量评定所有食品均不得检出致病菌病原菌种类：国家食品卫生标准中要求检验的病原菌至少有15中，食品种类繁多，只能根据不同食品可能污染情况针对性的重点检查。蛋、禽类、肉类必须检测沙门氏菌。低酸性罐头必须检测肉毒杆菌及其毒素。水产品一般检测副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌等。四、食品中的细菌菌相与食品卫生质量细菌菌相是指共存于食品中的细菌种类及其相对数量的构成。食品在细菌作用下所发生的变化程度和特征，尤其是变化特征主要决定于菌相，特别是优势菌种。复习题目 1、食品的卫生标准内容包括哪些？2、对食品进行微生物检验具有何意义？3、食品微生物检验的范围包括哪些？4、食品卫生标准中的微生物指标有哪些？第二章 食品微生物检验的基本条件的与设备学习目标：1）了解微生物检验室的基本要求通过学习能独立建设一般的食品微生物检验室。2）认识和熟悉微生物检验中常用仪器设备（尤其是普通光学显微镜）及其结构与性能，能正确使用和进行一般的维护。3）认识和熟悉微生物检验中常用玻璃器皿，掌握灭菌消毒的技术要求。第一节微生物检验室微生物检验室要求高度清洁卫生，要尽可能地为其创造无菌条件。为达此目的，房屋的墙壁和地板，使用的各种家具都要符合便于清洗的要求。一、检验室建设要求选址与规模（1）化验室应建设在远离粉尘、噪声、散发异味气体等地点电源电压应当相对稳定的地点。根据企业规模和产品点，应建设不同要求的化验室。但是，最小建筑面积：理化检验室不能小于30平方米；微生物检验室（无菌室）不能小于8平方米。这样有助于仪器设备的合理摆放，便于操作，便于样品流通和空气流通。（2）室内应有足够的照明条件。（3）室内必须配置干粉或二氧化碳灭火器，以备电器或化学品燃烧灭火使用。（4）所有电器插坐均应有牢固的地线装置，以防止设备带电，造成操作人员触电事故。有条件的还应在地面铺设绝缘胶板。其次还应必须有上下水设施、通风橱（在通风橱内进行对发生出有害气体的分析操作）。室内的布局(1)动仪器与静仪器分开：精密仪器（如光度计、天平、比色计、酸度计、色谱仪等）应必须与震动仪器（如震荡器、验粉筛、离心机、搅拌器等）。(2)常温与热源设备分开：热源仪器（如电热蒸馏水器、恒温干燥箱、高温电阻炉、恒温培养箱、水浴锅、电炉等）必须与其它一切设备分开，不然会影响其它设备的正常使用，严重的会造成热蒸汽腐蚀其它设备，影响其使用寿命。(3)化学分析台与热源设备分开：化学分析台面上应尽量少放易燃和腐蚀性试剂。使用电炉或酒精灯加热时应坚持有人看管和监视。化学分析台的摆放应远离热源设备。化验室应建立可行的规章制度：化验室人员工作管理制度、标准管理制度、危险化学试剂的管理制度、检验过程的管理制度、检测设备检定管理制度1、新建无菌室的处理程序先用3%的煤酚皂擦洗工作台面及地面，再用甲醛加高锰酸钾熏蒸空气。日后要定期熏蒸；每两星期用酒精棉球擦拭紫外线灯管；每次使用无菌室前用紫外灯照射3060分钟；每次使用完无菌室后，要及时用3%的煤酚皂擦洗工作台面及地面。2、超净工作台的使用使用工作台时，先经过清洁液浸泡的纱布擦拭台面然后用消毒剂擦拭消毒。接通电源，提前50分钟打开紫外灯照射消毒，处理净化工作区内工作台表面积累的微生物，30分钟后，关闭紫外灯，开启送风机工作台面上，不要存放不必要的物品，以保持工作区内的洁净气流不受干扰操作结束后，清理工作台面，收集各废弃物，关闭风机及照明开关，用清洁剂及消毒剂擦拭消毒。最后开启工作台紫外灯，照射消毒30分钟后，关闭紫外灯，切断电源。每二月用风速计测量一次工作区平均风速，如发现不符合技术标准，应调节调压器手柄，改变风机输入电压，使工作台处于最佳状况。 每月进行一次维护检查，并填写维护记录。 每次使用完毕，立即清洁仪器，悬挂标识，并填写仪器使用记录。取样结束后，先用毛刷刷去洁净工作区的杂物和浮尘，用细软布擦拭工作台表面污迹、污垢目测无清洁剂残留，用清洁布擦干；要经常用纱布沾上酒精将紫外线杀菌灯表面擦干净,保持表面清洁,否则会影响杀菌能力；设备内外表面应该光亮整洁，没有污迹。一、常用仪器及其使用 .显微镜 .冰箱 .超净工作台、杀菌锅.离心机 .水浴锅、培养箱 .烘箱或干燥箱.匀质器 .各种玻璃器材（一）显微镜普通显微镜的保养1、观察完后，移去观察的载玻片标本。2、用过油浸镜的，应先用擦镜纸将镜头上的油擦去，再用擦镜纸蘸着擦镜液擦拭23次，最后再用擦镜纸将二擦镜液苯擦去。3、转动物镜转换器，放在低倍镜的位置。4、将镜身下降到最低位置，调节好镜台上标本移动器的位置，罩上防尘套。（二）、培养箱1.智能隔水恒温培养箱2.隔水培养箱3.电热培养箱4.生化培养箱1、普通恒温培养箱卧式恒温振荡培养箱智能培养箱微电脑智能化双目控温系统具有控温保护、准确、可靠。工作温度任意调节并具有偏差报警功能，镜面不锈钢内胆，外门内层用一层门，观察箱内情况时不影响箱内温度。9000系列隔水式加热方式，具有温度均匀且断电后仍能保持较长时间恒温。隔水式培养箱.隔水式培养箱数字控温，不锈钢内胆，俗称水夹套培养箱。温度均匀，断电后仍能保持较长时间恒温。电热恒温培养箱2生化培养箱3、二氧化碳培养箱培养箱的配置和使用配置：22（）、30（）、37（）培养箱各一个使用注意事项：(1)箱内不能放入过热或过冷的物品，取放物品时应快速进行并做到随手关闭箱门。(2)内放一杯水，以保持湿度。(3)培养物不能放在最底层，也不得放置过于拥挤。(4)每月消毒一次，先用3%的来苏尔液涂布消毒，再用清水擦净。(5)不得当烘箱使用。4、水浴锅（1）37 和42 水浴锅24小时工作；（2）其余水涡锅用后关掉电源；（3）水浴锅内应注加蒸馏水而非自来水，使用时请注意水位。（三）匀质器无菌均质器该均质器广泛用于动物组织、生物样品、食品、化妆品的均质处理，特别适合于微生物检测样本的制备，具有均质柔和、样品无污染、无损伤、不升温、不需灭菌处理、不需洗刷器皿的特点，样本装在特制的一次性无菌均质袋中，不与仪器接触，预防交叉污染。（四）、超净工作台三大类型：侧流式、直流式和外流式超净台的使用和注意事项1使用前先打开紫外灯照射，紫外线照射时间4060分钟2、使用中，有机玻璃罩受到污染，严禁用酒精棉球擦拭，请用含水棉布檫拭；3、请保持超净台整洁，不要堆积杂物；4、使用完毕，勿忘关闭煤气开关或酒精灯；5、请做好使用记录。6、如遇故障，除记录在册外，还应及时与有关人员联系，尽早排除故障。7学期开始做无菌试验一次，以保证净化台正常使用。平时可根据情况，定期做无菌试验，以测定净化台是否符合无菌要求。（五）离心机.离心机的类型：.普通离心机.高速离心机.超速离心机类型普通离心机高速离心机超速离心机最大转速(r/min)6000 25000 可达75000以上最大RCF（g）600089000 可达510000以上分离形式固液沉淀固液沉淀分离密度梯度区带分离或差速沉降分离转子角式和外摆式转子角式、外摆式转子等角式、外摆式、区带转子等仪器结构性能和特点速率不能严格控制，多数室温下操作有消除空气和转子间摩擦热的制冷装置，速率和温度控制较准确、严格。备有消除转子与空气摩擦热的真空和冷却系统，有更为精确的温度和速度控制、监测系统、有保证转子正常运转的传动和制动装置等。应用收集易沉降的大颗粒（如RBC、酵母细胞等）收集微生物、细胞碎片大细胞器、硫酸铵沉淀物和免疫沉淀物等。但不能有效沉淀病毒、小细胞器（如核糖体）、蛋白质等大分子主要分离细胞器、病毒、核酸、蛋白质、多糖等甚至能分开分子大小相近的同位素标记物15N-DNA和未标记的DNA。转子许多离心机可以配用不同大小的离心管，只需要改变转子或使用一个与不同的吊桶/适配器相配的转子。.1水平转子：盛样品的离心管放在吊桶内，以转子的加速度运转。水平转子用于低速离心机，其主要缺陷是延长了沉淀的路径。同时，减速过程中产生的对流于低速离心机，其主要缺陷是延长了沉淀的路径。同时，减速过程中产生的对流会引起沉淀物的重新悬浮。.2角式转子：许多高速离心机及微量离心机安装。由于沉降路径短，沉淀颗粒时角式转子比水平转子的效率更高。.3垂直管转子：用于高速及超高速离心机进行等密度梯度离心时。这种转子在沉淀没有形成之前不能用来收集悬浮液中的颗粒。（六）、灭菌器.干热灭菌器.湿热灭菌器1、电烘箱（干燥箱）用途：用于玻璃器皿等耐热物品的烤干和灭菌。玻璃器皿等物的灭菌，温度160165，温度160165，灭菌2小时。玻璃器材的干热灭菌方法 (1)将培养皿、吸管等玻璃器皿洗净干燥后，用报纸包好，或装入特制的铁筒中。(2)将包装好的玻璃仪器摆入电热烘箱中，彼此间留有一定的空隙以便流通空气。(3)关紧箱门，打开排气孔接上电源。(4)待箱内空气排出到定程度时，关闭上排气孔，继续加热至一定温度后，调节温度控制旋钮固定温度，在160165保持2小时即可。(5)待自然降温冷却后(60以下)才能开门取出玻璃2、高压灭菌锅.用途：培养基、生理盐水、废弃物、采样器、纱布、衣物的灭菌。.种类：手提式、立式、卧式杀菌锅大型高压蒸汽杀菌锅的基本操作方法1.放干消毒锅内的剩余水，加入纯净水至最高水位；2.放入物品，关上消毒锅门；冷凝阀开1圈；消毒钮顺时针拨至“关”；3.选择所需的杀菌压力0.07、0.11或0.14Mpa后；开启电源；4.当温度达到100左右时就可将消毒钮顺时针拨至“消毒”及冷凝阀关至刚好有冷凝水和蒸气冒出为止；5.当消毒室温度达到所需温度时开始计时，到时间后关闸。使用高压蒸汽杀菌锅的注意事项A：为避免烫伤，只有当温度降低到70以下时放可小心的打开消毒锅门。B：为避免消毒锅冷却后消毒室内产生负压而打不开消毒锅门，所以当消毒室温度低于70时就可慢慢把门打开。C：根据消毒物品选择排气方式：（1）.如有液体（营养液等）请选择慢排。（2）.如只有废品等可选择快排。手提式高压蒸汽灭菌锅的使用方法（1）、关好排水阀门放入清水至标度为止。（2）、将要灭菌的物品用牛皮纸盖好后放入灭菌锅中，关上器盖。（3）、通电加温，同时打开排气活门，排尽锅内的空气，再关闭活门。（4）、当达到所需温度时开始计时，并在此温度下保持所需的时间。（5）、稍微打开一点排气活门，使锅内蒸气缓慢排除。（6）、当压力表指针降到零、锅内蒸气完全排尽时，立即打开锅盖取出物品。（7）、最后将高压灭菌器内的剩余水排出。思考题.干热灭菌和高压蒸汽法适用范围如何?.电热烘箱和高压锅如何操作?各有哪些使用注意事项? 3、滤菌器（七）、普通冰箱冰柜1、取用冰箱冰柜内物品尽可能快，取完后及时将有用物品放回原处；2、关冰柜门时应轻轻合上，同时将门轻轻往外拉一下检查是否关好; 3、冰柜内的不要样品应及时清理。快速自动菌数导电测定仪1、可直接测读菌体本身在培养液中造成的导电度变化，或利用菌体在代谢过程中的产物所造成的导电度变化，快速测定样品中细菌含量数目。2、适用于各种食品，制药，石化工厂的微生物品质管理，取代传统方法将侦测时间由3-5天减到几个小时。亦可用于做样品的抗菌性试验。细胞/颗粒分析计数仪细胞的总数、细胞的直径、平均直径、细胞浓度等。仪器全自动操作，避免人工操作的误差数据精确，省时省力是您作细胞研究的好助手，是研究细胞的更高层次的选择二、常用玻璃仪器及用具（一）量器类1、移液管1ml，2ml，5ml，10ml，25ml 2、容量瓶50ml，100ml，250ml，500ml，1000ml 3、量筒容量（ml）10、25、50、10、25、500、1000、2000 4、微量取样器（二）、其他常用玻璃器皿1、培养皿3.5cm,7cm，9cm，15cm 2、试管各种试管的使用 . 13mmX100mm：生化反应及凝集反应. 15mmX150mm：斜面培养. 18mmX180mm：检样稀释3、三角瓶型号150ml，200ml，250ml，500ml，1L，2L，3L烧杯容量（ml）：30、50、100、150、250、400、600、1000、2000、3000 三、玻璃器皿的清洗和灭菌(一)、新购的玻璃器皿1、先用热肥皂水刷洗，流水冲净。2、再浸泡于的盐酸中数小时，最后用流水冲净。(二)、用过的玻璃器皿1、含油脂器材的清洗（1）、单独高压灭菌；（2）、趁热倒去污物；（3）、倒放在铺有吸水纸的篮子上，置100 烘箱中烤0.5h;（4）、再用5%的碳酸氢钠水煮两次，再用肥皂水刷洗干净。2、含菌试管的清洗.高压灭菌后，肥皂水刷洗干净，烘干或晾干备用。3、含菌平皿的灭菌（1）、底盖分开放，放入桶中，高压灭菌；（2）、趁热倒去污物；（3）、肥皂水刷洗干净，烘干或晾干备用。4、含菌吸管的清洗（1）、把含菌吸管投入3%的来苏尔液内浸泡30min以上杀菌；（2）、用肥皂水洗涤一次；（3）、最后用清水冲洗干净即可。5、载玻片及盖玻片的清洗（1）将载玻片及盖玻片分别浸入5 %的来苏尔液内浸泡过夜，取出水洗干净；（2）盖片用软布擦干即可；（3）染色用的载玻片要放入肥皂水中煮沸10min，再用肥皂水刷洗干净，最后用95%的酒精浸泡片刻，晾干备用。（三）、玻璃器材的灭菌（1）清洗后烘干；（2）加塞包扎；（3）灭菌:干热灭菌:160 165烘箱中烤2h 思考题1、在微生物实验室中如何配置培养箱,使用中要注意哪些问题? 2、在微生物实验室中如何配置水浴锅,使用中要注意哪些问题? 3、如何正确使用超净台? 4、如何正确使用干热灭菌方法对玻璃器材进行灭菌? 5、简述手提式高压蒸汽灭菌锅的使用方法6、如何进行玻璃器皿的清洗和灭菌?第三章 培养基和实验基本操作技术第一节 培养基一、培养基中的主要成分及其作用（一）、营养物质N源、C源、无机盐、生长因子、水1、 常用的N源物质蛋白胨牛肉膏肉浸汁酵母膏（1） 蛋白胨有：普通蛋白胨和胰蛋白胨（2） 牛肉浸液成份：含氮物：肌酸、嘌吟、核苷酸尿酸肌肽等糖类物质：葡萄酒3肝糖、肝糖、P-已糖生长因子：硫胺、核黄素、泛酸、叶酸等8种B族维生素（3） 组织浸液组织浸液，主要为微生物生长繁殖提供可溶性含氮物质、核酸降解物、维生素及无机盐等，补充蛋白胨营养成分的不足部分。包括动物组织浸液、植物组织浸液、微生物细胞浸液。2、糖、醇类物质单糖：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖双糖：蔗糖、麦芽糖、乳糖多糖：淀粉、纤维素、菊糖醇类：甘露醇、卫茅醇、甘油（二）、水用蒸馏水，不能用自来水（三）、凝固剂琼脂、明胶、血清等要求：清一色杂质少（四）、抑制剂1、作用：鉴定细菌、抑制杂菌的生长繁殖，增加待检菌的检出率2、种类：盐类：氯化钠、氯化锂、氰化钾、亚碲酸钾（钠）、亚硒酸钠等染色剂类：煌绿、蔷薇酸、结晶紫、孔雀绿、孟加拉红、玫瑰红胆盐类：猪（牛、羊）胆盐、混合胆盐、三号胆盐、去氧胆酸盐、胆石酸盐抗菌素：青霉素、链霉素、杆菌肽、多粘菌素（五）、指示剂1、作用：用于指示鉴别细菌可否利用分解糖醇类物质、和含氮化合物，产酸产碱的能力。2、常用的指示剂：酚红、溴甲酚紫、中性红、中国蓝、甲基红、复红、伊红、美蓝、孔雀绿等二、培养基的类型在实验室中配制的适合微生物生长繁殖或累积代谢产物的任何营养基质，都叫做培养基 (Media)。由于各类微生物对营养的要求不同，因而培养基的种类很多。我们可根据某种标准，将种类繁多的培养基划分为若干类型。（一）、根据培养基的物理状态来区分固体培养基液体培养基半固体培养基1、液体培养基主要用于增菌培养、鉴别性培养2、固体培养基用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定等3、半固体培养基观察微生物的动力，有时用来保藏菌种。（二）、根据培养基的用途来区分增殖培养基选择培养基鉴别培养基1、增殖培养基在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基。增菌、运送用培养基B2胆盐乳糖培养基（BL）大肠杆菌增菌B3亚硒酸盐增菌培养基沙门氏菌增菌B4亚硒酸盐半胱氨酸增菌培养基食品中沙门氏菌增菌B5四硫磺酸钠亮绿基础培养基沙门氏菌增菌B6GN肉汤培养基志贺氏菌增菌B7碱性蛋白胨水培养基霍乱弧菌增菌B87.5%氯化钠肉汤培养基金黄色葡萄球菌增菌B9缓冲蛋白胨水培养基沙门氏菌增菌B10血液增菌培养基血液中细菌增菌B1 1SCDLP液体基础培养基化妆品中细菌增菌2、选择培养基在培养基中加入某种物质以杀死或抑制不需要的菌种生长的培养基，称之为选择培养基。分离培养用的培养基名称用途S琼脂培养基沙门氏和志贺氏菌属分离HE琼脂培养基志贺氏菌分离鉴别伊红美蓝琼脂培养基大肠杆菌、产气杆菌分离鉴别麦康凯琼脂培养基（MacC）肠道致病菌分离甘露醇高盐琼脂培养基绿脓杆菌分离鉴别XLD琼脂培养基志贺氏、沙门氏菌分离中国蓝琼脂培养基肠道菌分离鉴别碱性琼脂培养基乱弧菌分离高盐蔡氏琼脂培养基真菌、酵母菌分离3、鉴别培养基在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助开快速鉴别某种微生物。这样的培养基称之为鉴别培养基。鉴别用培养基名称用途蛋白胨水培养基靛基质和霍乱红试验乳糖胆盐发酵培养基大肠杆菌发酵乳糖试验0.5%乳糖发酵培养基肠道菌生化试验（复发酵）半固体培养基动力试验和菌种保存三糖铁琼脂培养基（TST）肠杆菌糖发酵及硫化氢反应氰化钾基础培养基沙门氏菌分离脱羧酶试验对照培养基细菌脱羧酶试验（三）培养基制备的基本方法和注意事项.培养基的制备记录.培养基成分的称取.培养基各成份的混合和溶化.培养基pH的初步调正.培养基的过滤澄清.培养基的分装.培养基的灭菌.培养基的质量测试.培养基的保存1、 培养基的制备记录每次制备培养基均应有记录，包括培养基名称，配方及其来源，和各种成份的牌号，最终pH值、消毒的温度和时间制备的日期和制备者等记录应复制一份，原记录保存备查，复制记录随制好的培养基一同存放、以防发生混乱。2、培养基成分的称取培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱，最好一次完成，不要中断。可将配方置于傍侧，每称完一种成分即在配方上面做出记号，并将所需称取的药品一次取成分即在配方上面做出记号并将所需称取齐，置于左侧，每种称取完毕后，即移放于右侧。完全称取完毕后，还应进行一次检查。3、培养基各成份的混合和溶化指示剂应在调节好PH值后再加入；煮溶后要补加足水份；不能把培养基煮焦，焦化的不能使用。4培养基pH的校正灭菌后PH值会下降0.10.2，在做培养基校正PH值时，应比实际值高0.10.2；PH调整后，还应将培养基煮沸。5、培养基的过滤澄清液体培养基可用滤纸过滤法琼脂培养基,可用中间夹有薄层吸水棉的双层纱布过滤、培养基的分装斜面： 1/管半固体培养基： 1/3管高层斜面： 1/41/3管平板： 1315ml7、培养基的灭菌（1）含糖类或明胶的培养基： 113灭菌15分钟或115灭菌10分钟。（2）无糖培养基： 121灭菌1520分钟。（3）血液、体液和抗生素等以无菌操作技术抽取后再加入冷却至约50左右的培养基中。（4）琼脂斜面培养基应在灭菌后冷至55-60时取出，再摆置成适当斜面。8、培养基的质量测试（）如发现破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染等、均应挑出弃去。并测定其最终pH。（）将全部培养基放入36±1恒温箱培养过夜，如发现有菌生长，即弃去。（）用有关的标准菌株接种12管或瓶培养基，培养2448小时，如无菌生长或生长不好。应追查原因并重复接种一次，如结果仍同前，则该批培原因并重复接种一次，如结果仍同前，则该批培养基即应弃去，不能使用。9、培养基的保存（1）基础培养基不能超过两周（2）生化试验培养基不宜超过一周（3）选择性或鉴别性培养最好当天使用，倾注的平板培养基不宜超过3天。思考题1、加入培养基中的抑制剂有什么作用，常用的抑制剂有哪些？2、在制备培养基时，将各成份溶化时要注意哪些问题？3、在制备培养基时，如何进行培养基pH的初步调正？4、如何选择培养基的灭菌条件？5、如何进行培养基的保存？配药结束的注意事项1.清理配药桌面与天平2.清洗秤药匙，擦干放回3.药品放回药品柜注意事项杀菌釜使用进入杀菌釜之物品，盖子不可关太紧或太松。减菌结束后，等压力降回零时才可打开门拿减菌后物品请记得带耐热手套。第二节、微生物检验的基本操作技术主要内容.无菌技术.M的接种与分离技术.微生物的培养方法.微生物的生长现象与观察一、无菌技术（一）无菌技术指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。（二）无菌环境.无菌室.无菌柜.超净工作台1、无菌室（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间（2）无菌室的消毒和防污染.每日（使用前）紫外线照射（12小时）.每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）.每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。2、超净工作台超净台的使用与保养:（1）风速保持在0.32-0.48米/秒;（2）使用前开启紫外灯照射30分钟以上;（3）让超净台预工作1015分钟;（4）使用完毕后，用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净.（三）无菌器材.灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌衣等.消毒器材：无菌室内的凳子、试管架、天平、工作台、手等（四）无菌操作1、目的：（1）是保证待检物品不被环境中微生物的污染；（2）是防止被检微生物在操作中污染环境或感染操作人员2、进入无菌室前的准备（1）、定期检查无菌环境的空气是否符合规定；（2）、用紫外线灭菌处理3060分钟；（3）检查无菌器材是否完备；（4）、洗手消毒；（5）、手部消毒后，再穿戴无菌工作服。3、检验操作过程的无菌操作要求（1）、在操作中不应有大幅度或快速的动作；（2）、使用玻璃器皿应轻取轻放。（3）、在正火焰上方操作；（4）、接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；（5）、在接种培养物时，协作应轻、准（6）、不能用嘴直接吸吹吸管。（7）、带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒。二、微生物的接种与分离技术（一）接种将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。、接种工具和方法1接种针2.接种环3.接种钩4.玻璃涂棒5.接种圈6 接种锄7.小解剖刀常用的接种方法有以下几种：）划线接种）三点接种）穿刺接种）浇混接种）涂布接种）液体接种）注射接种）活体接种 (二)、分离纯化、倾注平板法、涂布平板法、平板划线法1.斜线法2.曲线法3.方格法4.放射法5.四格法三、微生物的培养方法.一般培养法（需氧培养）.厌氧培养法.CO2培养法（一）、一般培养法（需氧培养）培养温度:2537（二）、厌氧培养方法1、简易的厌氧培养法：（1）庖肉培养法（2）厌氧缸法（3）焦性没食子酸法2、厌氧罐法3、厌氧手套箱法A厌氧缸法厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养。B、厌氧罐法使用：装入待培养的对象，然后密闭罐盖，接着可采用抽真空采用抽真空灌氮抽真空灌氮抽真空灌混合气(N2CO2H2=801010，V/V)。（三）、二氧化碳培养法1、烛缸法：2、二氧化碳置換法3、化学法：每一升用重碳酸钠0.4克与浓盐酸0.35亳升加入4二氧化碳培养箱法四、微生物培养特性观察与记录在固体培养基上，观察：菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等；在液体培养中：表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种：观察运动、扩散情况。思考题 1、什么是无菌技术？ 2如何做好无菌室的消毒和防污染工作？3、如何做好超净台的使用与保养？4、无菌操作的目的是什么？5、进入无菌室前要做好哪些准备工作？6、实验操作过程的无菌操作要求包括哪些内容？第四章 微生物的生化试验和血清学试验第一节 细菌的的生化试验一、概述（一）、什么是生化试验?指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验。 （二）检验细菌的生化试验范围1、糖（醇）类代谢试验2、氨基酸和蛋白质代谢试验3、有机酸盐和铵盐的利用试验4、呼吸酶类试验5、毒性酶类试验（三）生化试验的方法1.在培养物中加入某种底物与指示剂,经接种、培养后,观察培养基的PH值变化。2.在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。3.根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。4.根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。（四）生化试验的注意事项1、待检菌应是新鲜培养物。培养1824h。2、待检菌应是纯种培养物。3、遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多为24或48小时。4、应做必要的对照试验。5、提高阳性检出率，至少挑取23待检的疑似菌落分别进行试验。二、糖醇类代谢试验（一）糖醇类发酵试验（二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验（三）V-P试验（四）甲基红（Methyl Red）试验MR（五）七叶苷水解试验（六）甘油品红试验（一）糖醇类发酵试验1.原理：不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所产生的代谢产物各不同，有的能分解多种糖醇，有的只能分解12种糖醇，有的分解糖醇能产酸产气，有的分解糖醇只产酸不产气，根据这些特点，可鉴别细菌。常用的糖醇常用的糖醇单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖、鼠李糖双糖：乳糖、蔗糖、麦芽糖、蕈糖三糖：棉子糖多糖：菊糖、肝糖、淀粉醇类：甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇常用的糖醇常用的糖醇单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖双糖：乳糖、蔗糖、麦芽糖、蕈糖三糖：棉子糖多糖：菊糖、肝糖、淀粉醇类：甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇2、 试验方法：用接种针或环移取纯培养物少许，接种于糖发酵管中，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。置36±1.0培养13天，每天观察结果。3、结果观察和记录记录：.产酸不产气，阳性，以“+”表示.产酸产气，阳性，以表示.不产酸产气，阴性，以“-”表示（二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验1、原理：细菌对葡萄糖的分解，分为氧化型和发酵型。氧化型细菌在有氧的条件下才能分解葡萄糖，无氧的条件下不能分解葡萄糖；发酵型细菌在有氧无氧条件下均可分解葡萄糖；不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。根据糖管的色泽变化可鉴别细菌。3、 方法.取待