2022年SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理和操作步骤 .pdf

SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 实验原理和操作步骤实验原理：SDS-PAGE 是对蛋白质进行量化， 比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。 该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。SDS 是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS 蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后， 电荷因素可被忽略。 蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。试剂和器材：试 剂 ： 1. 5x样 品 缓 冲 液 （ 10ml ） :0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油， 2ml 10% 的 SDS，0.5ml 巯基乙醇， 1ml 1% 溴酚蓝， 0.9ml 蒸馏水。可在 4保存数周，或在20保存数月。2. 凝胶贮液： 在通风橱中， 称取丙烯酰胺 30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g ，加重蒸水溶解后， 定容到 100ml 。过滤后置棕色瓶中， 4保存，一般可放置 1个月。3. pH8.9 分离胶缓冲液：Tris 36.3g ，加 1mol/L HCl 48ml，名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -精心整理归纳 精选学习资料 - - - - - - - - - - - - - - - 第 1 页，共 4 页 - - - - - - - - - 加重蒸水 80ml 使其溶解，调 pH8.9 ，定容至 100ml ， 4保存。4. pH6.7 浓缩胶缓冲液：Tris 5.98g ，加 1mol/L HCl 48ml，加重蒸水 80ml 使其溶解，调 pH6.7 ，定容至 100ml ， 4保存。5. TEMED （四乙基乙二胺）原液6.10% 过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）7. pH8.3 Tris- 甘氨酸电极缓冲液： 称取 Tris 6.0g ， 甘氨酸 28.8g ，加蒸馏水约 900ml ， 调 pH8.3 后， 用蒸馏水定容至 1000ml 。 置4保存，临用前稀释 10倍。8. 考马斯亮蓝G250 染色液：称 100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml 蒸馏水中， 慢慢加入 7.5ml 70% 的过氯酸， 最后补足水到250ml ，搅拌 1小时，小孔滤纸过滤。器材：电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。实验操作名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -精心整理归纳 精选学习资料 - - - - - - - - - - - - - - - 第 2 页，共 4 页 - - - - - - - - - （一）样品制备将蛋白质样品与 5X 样品缓冲液 （20ul 5ul ）在一个 Eppendorf管中混合。放入 100加热510min ，取上清点样。（二）分离胶及浓缩胶的制备1 将玻璃板、样品梳、Spacer 用洗涤剂洗净，用ddH2O 冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干；2 将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer ，按照 Bio-Rad Mini /说明书提示装好玻璃板；3 按如下体积配制 10分离胶 8.0 ml ，混匀；ddH2O 3.0 ml 1.0 mol/LTris-HCl pH=8.8 2.1 ml 30% Acr-Bis 2.8 ml 10% SDS 80 ul 10%AP 56 ul TEMED 6 ul 4 向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20 min 后胶即可聚合；5 按 如 下 体 积 配 制 6 浓 缩 胶 3.0 ml ， 混 匀 ； ddH2O 1.0 mol/LTris-HCl pH=6.8 30% Acr-Bis 2.0 ml 400 ul 600 ul 10% SDS 10% AP TEMED 36ul 24ul 4ul 6 将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳；名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -精心整理归纳 精选学习资料 - - - - - - - - - - - - - - - 第 3 页，共 4 页 - - - - - - - - - 7 装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样20 l; 8 稳压 200V ， 溴酚蓝刚跑出分离胶时， 停止电泳，约需 45 min 1hr. 9 卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色12 hr ；加入脱色液， 置于 80 rpm 脱色摇床上 ,每20 min 更换一次脱色液（10 ml 冰乙酸； 45 ml 乙醇； 45 ml 蒸馏水）至完全脱净。名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -精心整理归纳 精选学习资料 - - - - - - - - - - - - - - - 第 4 页，共 4 页 - - - - - - - - -