备课素材：单克隆抗体的制备过程--高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3.docx

单克隆抗体的制备过程单克隆抗体就是从免疫的小鼠脾脏细胞中获取B淋巴细胞，在诱导剂的作用下与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，并通过体内培养或体外培养生产得到的。这种抗体与普通血清抗体相比较，具有特异强、灵敏度高的特点。在单克隆抗体的制备过程中，除了运用动物细胞融合技术，还运用动物细胞培养技术对杂交瘤细胞进行筛选和培养。单克隆抗体技术是1975年英国科学家Milstein和Kohler所发明，并获得1984年诺贝尔医学奖。骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体单克隆抗体，这种技术通称为杂交瘤技术。这一技术的基础是细胞融合技术。单克隆抗体技术的流程为：脾细胞和骨髓瘤细胞在聚乙二醇(PEG)作用下发生细胞融合；加入HAT选择培养基(含H、A和T)后，未融合的骨髓瘤细胞因其从头合成途径被氨基蝶呤阻断，而又缺乏HGPRT不能利用补救途径合成DNA，从而死亡；未融合的脾细胞难以在体外培养而死亡；融合细胞因从脾细胞获得HGPRT，故可在HAT选择培养基中存活和增殖。第一步：亲本细胞的准备致敏B淋巴细胞的准备：目的抗原免疫小鼠一般选用健康8周龄的纯系BALB/C小鼠作免疫动物。免疫用的目的抗原是各种病毒、细菌、癌细胞等。采用腹腔和皮下注射，每隔34天注射一次，连续34周后，检查抗体滴度效价（免疫学上的定量检测标准）。如符合要求，再由尾静脉作最后一次加强免疫，45天后，取脾脏分离B淋巴细胞备用。从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法：利用以生物标记的非B细胞淋巴细胞表面标志物抗体对脾脏细胞进行负筛选（对不需要的脾脏细胞杀死），再利用亲和素磁珠与磁性分离原理去除非B细胞，以提高脾脏细胞中B淋巴细胞相对丰度；利用荧光标记的IgM多克隆抗体和预标记筛选用抗原，对前面得到的脾脏细胞进行进一步负筛选，以流式细胞技术去表面不表达IgG分子的B细胞，保留与预标记筛选抗原结合的目标淋巴细胞；利用荧光染料7-AAD进行分选，去除死细胞；用流式细胞仪，进行单细胞的筛选，得到目标淋巴细胞。骨髓瘤细胞的制备：骨髓瘤细胞应尽可能用与B淋巴细胞来源相同的种系，而且必须具有代谢缺陷特征（次黄嘌呤磷酸核苷激酶缺陷HGPRT或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷TK）。另外，还要优化骨髓瘤细胞的培养条件，使其克隆形成率达到80%以上。第二步：细胞融合按一定比例（大多5：1）将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，并加入聚乙二醇（PEG）诱融剂诱导细胞融合。第三步：杂交瘤细胞融的筛选细胞融合后，将细胞转移到HAT培养液中，接种到96孔培养板中培养12周后，未融合的B淋巴细胞及其同核体，未融合的骨髓瘤细胞及其同核体相继死亡，杂交瘤细胞存活并形成细胞集落。第四步：可分泌特异性抗体的杂交瘤细胞的筛选对每个含有杂交瘤细胞集落生长孔中的上清液进行抗体检测，筛选出能够稳定分泌特异性单抗的杂交瘤细胞。常用的检测抗体的方法有放射免疫测定、酶联免疫吸附实验和免疫荧光测定等。主要以免疫源为靶抗原，以杂交瘤细胞生长孔内上清液为一抗，以放射性核素、酶或荧光素标记的兔/羊抗原IgG为二抗，利用放射性核素测定、底物显色或在荧光显微镜观察荧光颗粒，判断上清液是否含有相应的抗体（如图）。第五步：杂交瘤细胞的克隆培养筛选出的上清液为阳性的生长孔内通常会含有2个以上的杂交瘤细胞集落。有的集落可能不分泌抗体，或分泌的不是所需抗体。必须用克隆培养法让它们分离开。最常用的克隆培养法是有限稀释法和软琼脂培养法。前者是将稀释到一定密度的细胞接种到96孔培养板中，尽可能每个孔中只有一个细胞生长。后者是利用软琼脂的半固体性质，使单个的杂交瘤细胞在相对固定的位置上增殖形成细胞克隆。第六步：单克隆抗体的纯化和生产一种方法是体外培养杂交瘤细胞，然后收集上清液，通过离子交换、凝胶过滤或亲和层析等方法纯化得到单克隆抗体；另一种方法是将杂交瘤细胞接种到同系小鼠腹腔生长，然后抽取腹水，经离子交换、凝胶过滤或亲和层析等方法纯化得到单克隆抗体。例、（2020年全国卷1）为研制抗病毒A的单克隆抗体，某同学以小鼠甲为实验材料设计了以下实验流程。回答下列问题：（1）上述实验前必须给小鼠甲注射病毒A，该处理的目的是             。（2）写出以小鼠甲的脾脏为材料制备单细胞悬液的主要实验步骤:             。（3）为了得到能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞，需要进行筛选。图中筛选1所采用的培养基属于       ，使用该培养基进行细胞培养的结果是       。图中筛选2含多次筛选，筛选所依据的基本原理是        。（4）若要使能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞大量增殖，可采用的方法有            （答出2点即可）。答案：（1）诱导小鼠甲产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋巴细胞 （2）取小鼠甲脾脏剪碎，用胰蛋白酶处理使其分散成单个细胞，加入培养液制成单细胞悬液 （3）选择培养基   只有杂交瘤细胞能够生存   抗原与抗体的反应具有特异性 （4）将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内增殖；将杂交瘤细胞在体外培养 解析：由图可知，筛选1指用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，筛选2指进行克隆化培养和专一抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。 （1）实验前给小鼠甲注射病毒A，是为了诱导小鼠甲产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋巴细胞。 （2）取小鼠的脾脏，剪碎组织，用胰蛋白酶（或胶原蛋白酶）处理获得单个细胞，加入培养液可以制成单细胞悬液。 （3）图中筛选1需要用到选择培养基，只有杂交瘤细胞可以存活。筛选2是为了获得能产生特定抗体的杂交瘤细胞，该过程要用到抗原抗体杂交，故筛选所依据的原理是抗原抗体反应具有特异性。 （4）获得能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，可以在体外培养液中进行培养，或在小鼠的腹腔中进行培养，使杂交瘤细胞大量增殖。学科网（北京）股份有限公司