备课素材：PCＲ与琼脂糖电泳实验的改进--高二下学期生物人教版选择性必修3.docx

PC与琼脂糖电泳实验的改进聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PC)与琼脂糖电泳是高中生物学基因工程的常规实验。一次实验课的课时为 1 3 学时(45 min 2 h)，常规 PC 反应至少需要 1 5 2 h;琼脂糖电泳中制胶、制样、点样、电泳等过程至少需要 1 h;实验原理、操作步骤的讲述、学生动手操作、结果点评等过程至少需 1 h;总体一次 PC 与琼脂糖电泳实验需要 4 h，无法满足教学需要。通过改进 PC 反应体系、缩短仪器运行及电泳时间，从而做到在单学时内顺利完成 PC 及电泳实验，以便教师有足够的时间可充分解释实验原理、总结实验结果，帮助学生提高分析、解决问题的能力，满足PC 与电泳实验的教学需求，提高实验教学效果。改进 PC 反应体系，减少加样种类常规 PC反应体系包括 PC反应缓 冲液、Mg2 + 、dNTP、TaqDNA 聚合酶、一对引物、模板 DNA、H2O，反应需加 7种试剂。本实验选用 2 × EasyTaq PC SuperMix 试剂，该试剂包括了PC扩增所需的反应缓冲液、Mg2 + 、dNTP、Taq DNA 聚合酶 4 种试剂，用表 1 反应体系、只需要加 4 种试剂，缩短了加样过程，更方便学生操作。减小扩增目的片段的大小，缩短单次循环反应时间。吊兰是常见的室内观赏植物，实验用吊兰基因组DNA( gDNA) 作模板，取材方便。用吊兰 gDNA 做模板，引物序列，扩增出来的 DNA 总长 315 bp。由于扩增的片断较小，变性、退火、延伸时间均由原来的 30 60 s 降低为 10 s(表 2)，PC 产物经 1% 琼脂糖电泳后均可发现明亮、单一扩增条带(图 1A1D)，表明该实验参数可用于基因片段的扩增。降低循环圈数，缩短总体反应时间。PC 循环圈数也是影响反应时间的一个关键因素，常规的循环圈数为 35 40，通过设置 20、25、30、35、40 个不同的循环圈数，发现循环圈数为 20 时，24 min 即可完成 PC扩增，且经检测发现，PC 产物条带明亮(图 1A1D，1)，可满足学生实验的需求。增大电压、缩短电泳时间。琼脂糖电泳电压要求为 3 5 V/cm，用 150 V 电压，分别电泳 5、10、15、20 min(图 1)，发现，电泳 10 min 后 DNA marker 中的100 bp、250 bp、500 bp 的条带可明显区分开，本实验设计扩增的片段为 315 bp，界于 250 500 bp 之间，电泳 10 min 足够用来观察条带，判断其位置(图 1B)。染料加入琼脂糖凝胶中，省略染色过程。常用的染色步骤有两种: 一种是先电泳，后染色;一种是将染料放入琼脂糖凝胶中，边电泳边染色。常用的 DNA 染料为 EB，EB 为强诱变剂，具有高致癌性，本实验选用相对较安全的染料 Geled，采用将该染料加入琼脂糖凝胶中的方法进行 DNA 染色，既相对安全，又节省了时间。通过以上改进，选用表 1 的反应体系、选用表 2 的反应参数，用 Geled 做染料加入琼脂糖凝胶中，150 V电泳 10 min，最终可以在 34 min 完成 PC 反应及电泳实验，且实验结果可满足学生实验。在快速完成该实验的过程中，以下几个问题值得关注: 首先，PC 实验中需要不同量程的微量移液器，该装备价格相对较高，且如果使用不当，极易损耗，如何让每一位学生都能正确、熟练运用微量移液器是一个值得探究的问题;其次，本实验中需要 2 × EasyTaq PC SuperMix 和毒性相对小的 Geled 为 DNA 染料，该染料价位相对较高，必使实验经费增加;最后，该实验操作步骤较多，学生是否具有较强的动手能力也是影响本实验在有效时间内顺利完成的一个关键因素，如何在有限的时间内提高学生的动手能力是一个值得关注的问题。学科网（北京）股份有限公司