最新北京化工大学仪器分析第三章高效液相色谱PPT课件.ppt

进入夏天，少不了一个热字当头，电扇空调陆续登场，每逢此时，总会进入夏天，少不了一个热字当头，电扇空调陆续登场，每逢此时，总会想起那一把蒲扇。蒲扇，是记忆中的农村，夏季经常用的一件物品。记想起那一把蒲扇。蒲扇，是记忆中的农村，夏季经常用的一件物品。记忆中的故乡，每逢进入夏天，集市上最常见的便是蒲扇、凉席，不论男女老忆中的故乡，每逢进入夏天，集市上最常见的便是蒲扇、凉席，不论男女老少，个个手持一把，忽闪忽闪个不停，嘴里叨叨着少，个个手持一把，忽闪忽闪个不停，嘴里叨叨着“怎么这么热怎么这么热”，于是三，于是三五成群，聚在大树下，或站着，或随即坐在石头上，手持那把扇子，边唠嗑五成群，聚在大树下，或站着，或随即坐在石头上，手持那把扇子，边唠嗑边乘凉。孩子们却在周围跑跑跳跳，热得满头大汗，不时听到边乘凉。孩子们却在周围跑跑跳跳，热得满头大汗，不时听到“强子，别跑强子，别跑了，快来我给你扇扇了，快来我给你扇扇”。孩子们才不听这一套，跑个没完，直到累气喘吁吁，。孩子们才不听这一套，跑个没完，直到累气喘吁吁，这才一跑一踮地围过了，这时母亲总是，好似生气的样子，边扇边训，这才一跑一踮地围过了，这时母亲总是，好似生气的样子，边扇边训，“你你看热的，跑什么？看热的，跑什么？”此时这把蒲扇，是那么凉快，那么的温馨幸福，有母亲此时这把蒲扇，是那么凉快，那么的温馨幸福，有母亲的味道！蒲扇是中国传统工艺品，在我国已有三千年多年的历史。取材的味道！蒲扇是中国传统工艺品，在我国已有三千年多年的历史。取材于棕榈树，制作简单，方便携带，且蒲扇的表面光滑，因而，古人常会在上于棕榈树，制作简单，方便携带，且蒲扇的表面光滑，因而，古人常会在上面作画。古有棕扇、葵扇、蒲扇、蕉扇诸名，实即今日的蒲扇，江浙称之为面作画。古有棕扇、葵扇、蒲扇、蕉扇诸名，实即今日的蒲扇，江浙称之为芭蕉扇。六七十年代，人们最常用的就是这种，似圆非圆，轻巧又便宜的蒲芭蕉扇。六七十年代，人们最常用的就是这种，似圆非圆，轻巧又便宜的蒲扇。蒲扇流传至今，我的记忆中，它跨越了半个世纪，也走过了我们的扇。蒲扇流传至今，我的记忆中，它跨越了半个世纪，也走过了我们的半个人生的轨迹，携带着特有的念想，一年年，一天天，流向长长的时间隧半个人生的轨迹，携带着特有的念想，一年年，一天天，流向长长的时间隧道，袅道，袅高效液相色谱法高效液相色谱法一、一、高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点二、流程及主要部件二、流程及主要部件三、固定相和流动相三、固定相和流动相四、四、主要分离类型主要分离类型五、五、影响分离的因素影响分离的因素SiSiOOOHClSiSiOOHOHCl Si(CH3)2RSiSiOOOSi(CH3)2RSi(CH3)2RR - 极性基团极性基团 疏水基团疏水基团 离子交换基团离子交换基团OHOH正相HPLC（normal phase HPLC）： 是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相是正己烷。吸附色谱也属正相HPLC。反相HPLC（reversed phase HPLC）： 由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶(ODS柱），代表性的流动相是甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式。ODS（Octa Decyltrichloro Silane)固定相性质固定相性质极性极性非极性非极性键合基团键合基团 极性基团极性基团疏水基团疏水基团流动相性质流动相性质非极性非极性极性极性出峰顺序出峰顺序 极性小先出极性小先出 极性大先出极性大先出吸附色谱法吸附色谱法 以固体吸附剂为固定相，如硅胶、以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂。流动相可以是各种的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂不同极性的一元或多元溶剂。 固定相为离子交换树脂，固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱流动相为无机酸或无机碱的水溶液。的水溶液。 各种离子根据它们与树脂上的交换各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。基团的交换能力的不同而得到分离。根据样品分子尺寸大小分离根据样品分子尺寸大小分离 大分子不能进入多孔中，不被保留，随大分子不能进入多孔中，不被保留，随 VmVm流出流出 中分子部分进入多孔中，一般保留中分子部分进入多孔中，一般保留 小分子完全进入多孔中，长时间保留。小分子完全进入多孔中，长时间保留。排阻色谱法排阻色谱法(凝胶色谱法凝胶色谱法)1. 1. 软凝胶：软凝胶：铰链葡萄糖的多孔聚合物，铰链葡萄糖的多孔聚合物，聚丙烯酰胺凝胶。（凝胶过滤色谱）聚丙烯酰胺凝胶。（凝胶过滤色谱）2. 2. 半硬凝胶：半硬凝胶：聚苯乙烯珠（凝胶渗透色谱）聚苯乙烯珠（凝胶渗透色谱）高硬凝胶和玻璃：高硬凝胶和玻璃：多孔玻璃或多孔硅球，多孔玻璃或多孔硅球，经化学键合处理，不随压力及溶剂改变经化学键合处理，不随压力及溶剂改变尺寸，（高效排阻色尺寸，（高效排阻色 谱）谱） 流动液贮存提供脱气流动液贮存提供脱气输液泵输液泵进样系统进样系统分离系统分离系统检测系统检测系统控制与记录系统控制与记录系统 高效液相色谱仪高效液相色谱仪高压输液泵：高压输液泵：高压输液泵是液相色谱仪的关键部高压输液泵是液相色谱仪的关键部件，其作用是将流动相以稳定的流件，其作用是将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。速或压力输送到色谱系统。输液泵的稳定性直接关系到分析结输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。果的重复性和准确性。 活塞泵活塞泵 注射泵注射泵 气动泵气动泵进样系统进样系统色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱泵泵泵泵12进进样样 不使整个压力变化的情况下将样品注入色谱柱，不使整个压力变化的情况下将样品注入色谱柱，通常使用所谓通常使用所谓六通六通进样系统进样系统色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。特性、填充质量和使用条件有关。 检测器检测器 用来连续监测经色谱柱分离后的流出物用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。的组成和含量变化的装置。紫外紫外- -可见检测器可见检测器荧光检测器荧光检测器电化学检测器电化学检测器蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器质谱检测器质谱检测器v 单波长单波长UVUV检测器，光源用检测器，光源用HgHg灯，加滤光灯，加滤光片可以到片可以到254254，280280，313313，334334，365365等。等。生化中用到很多。生化中用到很多。v 多波长多波长 光度计类似，光栅或棱镜分光光度计类似，光栅或棱镜分光A Alglg（I I0 0/ /I It t)= )= b cb c紫外紫外- -可见检测器可见检测器荧光检测器荧光检测器许多有机化合物，特别是芳香族化合物、许多有机化合物，特别是芳香族化合物、被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。但可以与发荧光物质激发光波长要长的荧光。但可以与发荧光物质反应衍生化后检测。反应衍生化后检测。 特点：特点： 有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵敏度要比紫外检测法高敏度要比紫外检测法高2 2 3 3个数量级，特别适合个数量级，特别适合于药物和生物化学样品的分析。于药物和生物化学样品的分析。荧光检测器结构示意图荧光检测器结构示意图光源光源检测器检测器滤光片滤光片检测室检测室蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器适合于无紫外吸收、无蒸发光散射检测器适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测。电活性和不发荧光的样品的检测。电化学检测器电化学检测器（以电导检测器为例）（以电导检测器为例）电导仪电导仪电极电极电极电极四种色谱分离模式的分离机理及应用范围四种色谱分离模式的分离机理及应用范围反相色谱的概念反相色谱的概念高效液相色谱应用实例高效液相色谱应用实例 柱后pH调节电导检测对有机酸具有高选择性和高灵敏度对有机酸具有高选择性和高灵敏度有机酸分析系统流程图有机酸分析系统流程图2348756 91011、2 泵 3 进样器 4 柱温箱 5 电导检测器 6 数据处理机 7 混合室 8 柱子 9 流动相 10 缓冲液分析条件分析条件分离条件分离条件 色谱柱：色谱柱：Shim-pack SCR-102H(8mmI.D300mmL.) 1个或个或2个分析柱连接个分析柱连接 保护柱保护柱 SCR-102H (6mmI.D.50mmL.)流动相流动相：5mM p-甲苯亚磺酸水溶液甲苯亚磺酸水溶液流量流量 ：0.8mL/min温度温度 ：40或或45检测条件检测条件缓冲液：缓冲液：20mM Bis-tris 水溶液水溶液 含含 5mM p-甲苯亚磺酸和甲苯亚磺酸和100 EDTA流量流量 ：0.8mL/min检测器检测器：电导检测器：电导检测器 polarity;+ 样品的分析实例样品的分析实例食品食品啤酒，清酒，葡萄酒，酱油等啤酒，清酒，葡萄酒，酱油等体液体液血清，尿等血清，尿等医药品医药品肾的透析液，钙制剂等肾的透析液，钙制剂等发酵发酵微生物培养液，酸奶等微生物培养液，酸奶等环境环境工厂废水等工厂废水等有机酸标准品的色谱图有机酸标准品的色谱图1 1一个分析柱一个分析柱 1. 1. 磷酸磷酸 2. 2. 柠檬酸柠檬酸 3. 3. 丙酮酸丙酮酸 4. 4. 苹果酸苹果酸 5. 5. 琥珀酸琥珀酸 6. 6. 乳酸乳酸 7. 7. 甲酸甲酸 8. 8. 乙酸乙酸 9. 9. 乙酰丙酸乙酰丙酸10. 10. 焦谷氨酸焦谷氨酸啤酒的色谱图啤酒的色谱图 1. 1. 磷酸磷酸 2. 2. 柠檬酸柠檬酸 3. 3. 丙酮酸丙酮酸 4. 4. 苹果酸苹果酸 5. 5. 琥珀酸琥珀酸 6. 6. 乳酸乳酸 7. 7. 甲酸甲酸 8. 8. 乙酸乙酸 9. 9. 焦谷氨酸焦谷氨酸10. 10. 碳酸碳酸前处理前处理振荡除去碳酸气后，振荡除去碳酸气后，过滤过滤1010进样进样清酒的色谱图清酒的色谱图 1. 1. 磷酸磷酸 2. 2. 柠檬酸柠檬酸 3. 3. 丙酮酸丙酮酸 4. 4. 苹果酸苹果酸 5. 5. 琥珀酸琥珀酸 6. 6. 乳酸乳酸 7. 7. 乙酸乙酸 8. 8. 焦谷氨酸焦谷氨酸前处理前处理过滤后，进样过滤后，进样1010min.葡萄酒的色谱图葡萄酒的色谱图 1. 1. 磷酸磷酸 2. 2. 柠檬酸柠檬酸 3 . 3 . 酒石酸酒石酸 4. 4. 苹果酸苹果酸 5. 5. 琥珀酸琥珀酸 6. 6. 乳酸乳酸 7. 7. 甲酸甲酸 8. 8. 乙酸乙酸 9. 9. 焦谷氨酸焦谷氨酸前处理前处理用水稀释用水稀释1010倍后过滤倍后过滤进样量进样量1010 min. 酱油的色谱图酱油的色谱图 1. 1. 磷酸磷酸 2. 2. 柠酸柠酸 3. 3. 丙酮酸丙酮酸 4. 4. 苹果酸苹果酸 5. 5. 琥珀酸琥珀酸 6. 6. 乳酸乳酸 7. 7. 甲酸甲酸 8. 8. 乙酸乙酸 9. 9. 乙酰丙酸乙酰丙酸10. 10. 焦谷氨酸焦谷氨酸前处理前处理用水稀释用水稀释1010倍后过滤倍后过滤进样量进样量1010 血清的色谱图血清的色谱图 1. 1. 磷酸磷酸 2. 2. 柠檬酸柠檬酸 3. 3. 丙酮酸丙酮酸 4. 4. 乳酸乳酸 5. 5. 甲酸甲酸 6. 6. 乙酸乙酸 7. 7. 焦谷氨酸焦谷氨酸 8. 8. 未知物未知物前处理前处理加高氯酸用离心法去沉淀物，加高氯酸用离心法去沉淀物，取上清液取上清液5uL5uL进样进样尿样的色谱图尿样的色谱图 1. 1. 磷酸磷酸 2. 2. 柠檬酸柠檬酸 3. 3. 乳酸乳酸 4. 4. 甲酸甲酸 5. 5. 未知物未知物 6 6. . 焦谷氨酸焦谷氨酸 7 7 未知物未知物前处理前处理过滤后，进样过滤后，进样1010酸奶的色谱图酸奶的色谱图 1. 1. 磷酸磷酸 2. 2. 柠檬酸柠檬酸 3. 3. 琥珀酸琥珀酸 4. 4. 乳酸乳酸 5. 5. 甲酸甲酸 6. 6. 乙酸乙酸前处理前处理用水稀释用水稀释1010倍后过滤倍后过滤进样量进样量1010 工厂废水的色谱图工厂废水的色谱图 1. 1. 甲酸甲酸 2. 2. 乙酸乙酸 3. 3. 丙酸丙酸 4. 4. 碳酸碳酸 5. 5. 丁酸丁酸 6. 6. 戊酸戊酸前处理前处理过滤后，进样过滤后，进样1010食品安全是所有国家的每个消费者关心的基本问题。残留农药和兽药是食品中主要的污染物世界上许多国家制定并实施食品安全法规，但是在美国、加拿大、欧盟以及日本食品安全法规更加严格的完善。在食品和农产品国际贸易中，残留农药和兽药的检测中非常苛刻的。食品安全与污染物食品安全与污染物 农产品农产品- 谷物：大米等 - 豆类：大豆、豌豆等。 - 水果：橘柑，苹果，葡萄等。 - 蔬菜：洋白菜（甘蓝）、菠菜等 - 茶叶，种子，蜂蜜等。食品中残留检测食品中残留检测 审查农药残留审查农药残留 家畜及水产品家畜及水产品- 牛肉，猪肉等 - 鸡肉、鹌鹑等 - 鱼类：黄尾鱼、虹鳟鱼，大马哈鱼等 - 虾，对虾审查兽药残留审查兽药残留全世界使用的农药超过700种：杀虫剂，除草剂，杀菌剂，脱叶剂，植物生长调节剂。残留：残存在农产品中的农药（降解缓慢）及其代谢物由以下原因所致： - 使用更稳定的化学物质作农药。 - 农药的过度使用以及不合理使用。最大残留限量(MRL)：食品安全的指标，通常MRL0.01-0.05mg/kg(ppm)食品中的农药残留食品中的农药残留农药的残留（农药的残留（1） 有机氯化物：有机氯化物：硫丹、荚蟥醚、克菌丹、抑菌灵、乙酯杀螨醇、溴螨酯、六六六、滴滴涕、异狄氏剂、敌菌丹、狄氏剂、六氯苯、七氯 有机磷化物：有机磷化物： 苯硫磷，乙硫磷，灭线磷，乙嘧硫磷，硫线磷，喹硫磷，毒死蜱，甲基毒死蜱，毒虫畏，蔬果磷，敌敌畏，乐果，二嗪磷，甲基嘧啶磷，杀螟硫磷，丰索磷，倍硫磷，稻丰散，丙硫磷，仗杀硫磷，马拉硫磷，杀扑磷，异稻瘟净，敌瘟磷，甲基立枯磷，特丁硫磷，抑草磷，苯腈磷，对硫磷，甲基对硫磷，甲拌磷 氨基甲酸酯：氨基甲酸酯：灭除威，异灭威，甲萘威，灭杀威，抗蚜威，仲丁威，残杀威，恶虫威，速灭威，乙霉威，氯丙嗪，禾草丹 拟除虫菊酯拟除虫菊酯氯氟氰菊酯，氟氯氰菊酯，氯氰菊酯，七氟菊酯，四溴菊酯，氰戊菊酯，氟氰戊菊酯，氟胺氰菊酯，氯菊酯 含氮化合物：含氮化合物： 甲氰菊酯，噻嗪酮，吡螨胺，恶霜灵，灭螨猛，三唑醇，三唑酮，氯苯嘧啶醇，氟酰胺，丙环唑，联苯三唑醇，灭锈胺，灭草灵，莠去津，双苯酸草胺，敌稗，二甲戊灵，氟乐灵，多效唑。农药的残留（农药的残留（2）在过去几年中，相关法规已完成或修订，控制程度更加严格。在欧盟和美国已建立起完整的监测网络（参考实验室；参考材料及标准；计算机监视小组等）在样品净化，色谱分离和检测中使用改进的和新的分析技术及方法，如GC/MS和LC/MS，就会产生更灵敏，更准确和更可靠的结果。公众比以前更加关注食品安全。欧盟和美国现在的形势欧盟和美国现在的形势 灭除威，异灭威，甲萘威，灭杀威，抗蚜威，仲丁威，残杀威，恶虫威，克百威 (呋喃丹),速灭威，乙霉威，氯丙嗪，禾草丹 氨基甲酸酯类农药丁醛肟威草肟威呋喃丹CPMC残杀威（PHC，Arprocarb）苯噁威 二甲杀威（MPMC）乙硫甲威灭定威甲萘威（NAC）XMC苯氧丁威（BPMC）甲硫威（Mercaptodimethur）异丙威（MIPC）乙肟威甲氧威（MTMC）氨基甲酸酯类农药结构氨基甲酸酯类农药结构N-N-甲基氨基甲酸酯的甲基氨基甲酸酯的HPLCHPLC分析方法流程图分析方法流程图 1、脱气装置 10、反应试剂输液机构 2、低压梯度装置 11、混合装置3、流动相输液机构 12、荧光检测器4、梯度混合器 13、阻尼盘管 5、自动进样器 14、反应盘管6、柱温箱 15、反应盘管7、分析柱 M1，M2：流动相8、化学反应箱 R1，R2：反应试剂液9、脱气装置N-N-甲基氨基甲酸酯的甲基氨基甲酸酯的HPLCHPLC分析方法分析方法 N-氨基甲酸甲酯类农药的基本化学结构式它们的化合物在碱的条件下加水分解生成甲胺。这里生成的甲胺与一级胺的荧化衍生化试剂O-苯二甲醛（OPA）反应，可进行较高灵敏度的荧光检测。 氨基甲酸酯前处理过程氨基甲酸酯前处理过程8成分的N-氨基甲酸甲酯类农药标准试样同时分析的色谱图 1994年6月9日官报上登载的成分的分析例 1616成分的成分的N-N-氨基甲酸甲酯类农药标准氨基甲酸甲酯类农药标准试样同时分析的色谱图试样同时分析的色谱图甲硫威及其代谢物甲硫威及其代谢物甲硫威代谢物高灵敏度分析例 （例如在橘子汁中不得含50ppb以上） 甲硫威的检测限（S/N=3）为2ppb 离子色谱离子色谱离子色谱过渡金属分析系统CN- 离子分析系统氨基酸分析系统氨基酸分析系统 氨基酸分析系统氨基酸分析系统 NH2 R C COOH H氨基酸衍生化方法氨基酸衍生化方法柱后衍生柱前衍生氨基酸衍生化后的氨基酸试剂试剂色谱谱柱检测检测器色谱谱柱检测检测器 氨基酸试剂试剂色谱谱柱检测检测器柱后衍生柱后衍生色谱谱柱 : 阳离子交换换柱试剂试剂 : 茚茚三酮酮方法 - UV/VIS 检测检测器 OPA方法 - 荧荧光检测检测器 氨基酸衍生化氨基酸衍生化色谱柱色谱柱检察器检察器柱前衍生柱前衍生 异硫氰酸苯脂异硫氰酸苯脂（PITCPITC）Column : Revered Phase Column (ODS)Reagent : OPA (Fluorescence)FMOC (Fluorescence)Fluorescamine (Fluorescence)DANS-Cl (Fluorescence)PITC (UV)柱前衍生步骤柱前衍生步骤1. 200uL样品中加入100mM异硫氰酸苯酯 （乙腈溶液）100uL和1M三乙胺（乙腈溶液） 100uL,室温下放置反应1小时2. 反应液中加入400uL己烷3. 放置，取下层溶液用一次性滤膜过滤器 （0 .45um ）过滤4. 取滤液4uL注入高效液相色谱重点高效液相色谱重点高效液相色谱法中的定性与定量分析方法；高效液相色谱法中的定性与定量分析方法；高效液相色谱法色谱条件的选择；高效液相色谱法色谱条件的选择；高效液相色谱法的分类及其分离机制；高效液相色谱法的分类及其分离机制；高效液相色谱仪的主要部件、功能原理和操作方法；高效液相色谱仪的主要部件、功能原理和操作方法；高效液相色谱的应用高效液相色谱的应用 。