最新发酵工程第二章发酵工业菌种幻灯片.ppt

本章内容本章内容 一、常用发酵工业菌种一、常用发酵工业菌种二、发酵工业菌种的分离筛选二、发酵工业菌种的分离筛选三、发酵工业菌种鉴定三、发酵工业菌种鉴定四、发酵工业菌种改良四、发酵工业菌种改良四、发酵工业菌种保藏四、发酵工业菌种保藏工业发酵微生物可培养微生物未培养微生物少数少数大多数大多数缺乏敏感检测技术缺乏敏感检测技术培养基中营养过剩培养基中营养过剩微生物间相互作用微生物间相互作用认识不足无法原位培养认识不足无法原位培养细菌放线菌酵母菌霉菌细菌醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌乳酸杆菌枯草杆菌丙酮丁醇梭菌大肠杆菌谷氨酸棒状杆菌主要用于生产酶制剂、有机酸、氨基酸、肌苷酸等。l醋酸杆菌醋酸杆菌生产醋酸、山梨醇、5-酮葡糖酸和酒石酸等；l乳酸菌广泛应用于乳酸的生产以及乳制品工业；l产氨短杆菌、谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌产氨短杆菌、谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌等可生产氨基酸、核苷酸等；l梭状芽孢杆菌梭状芽孢杆菌可生产丁二醇、丙酮、丁醇、乙醇、丙酮丁醇、核黄素以及一些有机酸；l枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌可生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、多肽类抗生素、氨基酸、维生素以及丁二醇等；l假单胞菌假单胞菌能生产维生素B12、色素、丙氨酸、葡糖酸以及一些抗生素和甾体等；l黄单胞菌黄单胞菌可生产维生素B12；l运动单胞菌运动单胞菌可生产乙醇；l大肠杆菌大肠杆菌可生产天冬氨酸、赖氨酸、苏氨酸、缬氨酸以及谷氨酸脱羧酶、天冬酰酶等。l细菌还用作基因工程载体的宿主细胞，用于构建基因工程菌来生产外源物质，如：利用大肠杆菌生产核酸和蛋白质疫苗。放线菌链霉菌属小单孢菌属诺卡菌属地中海诺卡氏菌米苏里游动放线菌主要用于生产多种抗生素多种抗生素，如链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等。酵母菌酿酒酵母假丝酵母属l产朊假丝酵母l解脂假丝酵母l热带假丝酵母毕赤酵母属、汉逊酵母属主要用于生产食用、药用和饲料用蛋白等。l酵母细胞本身含有丰富的蛋白质、维生素以及各种酶类，工业上常通过培养酵母制造单细胞蛋白，以供食用或作饲料蛋白，或用来制取核糖核酸、核苷酸、核黄素、细胞色素c、辅酶A、凝血质、转化酶和乳糖酶等。l在发酵工业上，经常利用酵母的代谢进行啤酒、白酒、黄酒和果酒等各种饮料酒的酿造，以及生产乙醇、甘油、有机酸及麦角固醇等多种产品。霉菌曲霉属l米曲霉l黑曲霉青霉属l青霉菌：点青霉、产黄青霉l桔青霉根霉属l德氏根霉l米根霉、小麦曲根霉红曲霉属l紫红曲霉主要用于生产酶制剂、有机酸、抗生素及甾体激素等。l霉菌除了应用于传统的酿酒、制浆和其他发酵食品生产外，还可用于生产乙醇、有机酸、抗生素、酶制剂、维生素、植物生长素以及甾体转化等。l黑曲霉黑曲霉用于生产酸性蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸、草酸以及抗坏血酸等；l红曲霉红曲霉能发酵生产红曲红色素、红曲黄色素、柠檬酸、琥珀酸、麦角固醇、洛伐他丁、淀粉酶、蛋白酶和酯化酶等；l产黄青霉产黄青霉用于生产青霉素、葡糖酸、抗坏血酸以及多种酶；l根霉根霉能产生反丁烯二酸、乳酸、琥珀酸、芳香脂和甾族化合物等；l毛霉毛霉能产生果胶酶、凝乳酶、甾族化合物以及应用于传统的制酱工业等。 未培养微生物l定义：指迄今所采用的微生物纯培养分离及培定义：指迄今所采用的微生物纯培养分离及培养方法还养方法还未获得纯培养未获得纯培养的微生物，其在自然环的微生物，其在自然环境微生物群落中占有非常高的比例，约为境微生物群落中占有非常高的比例，约为99，主要在各种极端环境中。主要在各种极端环境中。研研究方法究方法1、模拟自然培养法、模拟自然培养法：原位培养、培养条件优化、单细原位培养、培养条件优化、单细胞操作。胞操作。2、宏基因组分析法：测序分析未培养微生物的基因组，、宏基因组分析法：测序分析未培养微生物的基因组，结合蛋白质组学，了解其代谢途径、基因表达调控机制结合蛋白质组学，了解其代谢途径、基因表达调控机制等。等。第二节 发酵工业菌种的分离筛选菌种的来源l根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；l从大自然中分离筛选新的微生物菌种。 l菌株的分离分离和筛选筛选是获得目的菌株的两个重要环节。l分离：l筛选：注意采用方法的选择性和灵敏度 菌种选择的要求 l能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，且生成的目的能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，且生成的目的产物产量高、易于回收；产物产量高、易于回收； l生长速度和反应速度较快，发酵周期较短；生长速度和反应速度较快，发酵周期较短；l培养条件易于控制；培养条件易于控制；l抗噬菌体及杂菌污染的能力强；抗噬菌体及杂菌污染的能力强；l菌种不易变异退化；菌种不易变异退化；l对放大设备的适应性强；对放大设备的适应性强；l菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。素。从自然界筛选菌种从自然界筛选菌种l制定方案：制定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。l采样：采样：有针对性地采集样品。l预处理：预处理：提高菌种分离的效率l富集培养：富集培养：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。l分离：分离：利用分离技术得到纯种。l菌种的筛选：菌种的筛选：通过常规生产性能测定，进一步筛选产物合成能力较高的菌株。l发酵性能测定：发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。l菌种保藏菌种保藏新种分离与筛选的步骤新种分离与筛选的步骤1. 样品采样样品采样（1）采样原则u 广泛性u 充分了解目标微生物的性质（种类、生理特征等）如根据微生物的营养类型：如根据微生物的营养类型：l纤维素酶产生菌森林土壤l蛋白酶和脂肪酶产生菌肉类加工厂和饭店潲水沟中的污水、污泥l利用碳氢化合物为碳源的菌株油田附近极端菌的筛选要根据其特殊的生理特征：极端菌的筛选要根据其特殊的生理特征：l高温酶产生菌南方、温泉、火山爆发处及北方的肥堆l耐压菌油井或海洋深处（有机质丰富、通气保水性能好）（有机质丰富、通气保水性能好）(2) 采样对象 土壤、水、空气土壤、水、空气及枯枝落叶枯枝落叶等，以土壤土壤为主。从从土壤土壤中采样要考虑土壤的以下特点：中采样要考虑土壤的以下特点：l有机质含量和通风状况l耕地、菜园l山坡上的森林l沙土、无植被土壤、新开垦的生土、贫瘠的土地l取样的土层深度：5-25cm细菌、放线菌（有机质丰富、阴暗潮湿）霉菌、酵母菌微生物少1. 采样l土壤的酸碱度 偏碱细菌、放线菌 偏酸霉菌、酵母菌l土壤的植被状况 葡萄成熟时根部酵母菌增多l地理条件 南方土壤比北方土壤微生物含量多l季节条件 秋季菜土样最理想2.2.样品的预处理样品的预处理 （1）物理方法u热处理：根据目的菌较非目的菌的耐热性高 从而增加目的菌的比例。 u膜过滤法：浓缩水中的微生物细胞。u离心法：同上。（2）化学法 通过培养基中添加某些化学成分来增加微生物的数量。 如：用添加CaCO3稳定培养基的pH来分离嗜碱性的放线菌。（3）诱饵法 将某些固体物质如石蜡、花粉、蛇皮、毛发等加到分离的土壤或水中做成诱饵富集目的菌，待菌落长出后再进行分离。3. 富集培养l富集培养富集培养 利用不同微生物生长繁殖对环境和营养的不同要求，如温度、PH、渗透压、溶氧浓度、碳源和氮源类型及浓度等，使目的微生物在最适宜条件下迅速繁殖，数量增加，成为人工环境下的优势种。3. 富集培养l富集培养的策略（1）控制培养基的营养成分用促进某特定微生物生长繁殖的选择性培养基或培养条件。可用抑制其他微生物生长繁殖的选择性培养基或培养条件。 例如例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。3. 富集培养l富集培养的策略富集培养的策略（2）控制培养条件溶氧浓度好氧/厌氧高温嗜热微生物 /非嗜热微生物pH嗜酸性/嗜碱性 4. 菌种分离l平板划线分离法l稀释分离法l毛细管分离法l小滴分离法 划线分离法划线分离法平板划线法平板划线法稀释分离法稀释分离法 稀释倒稀释倒 平板法平板法 平板平板 涂布法涂布法注意：必须要做多个浓度的稀释分离平板。注意：必须要做多个浓度的稀释分离平板。样品充分混匀；样品充分混匀；每支移液管及涂布棒只能接触每支移液管及涂布棒只能接触一个稀释度的菌液；一个稀释度的菌液；同一稀释度三个以上重复同一稀释度三个以上重复,取平取平均值；均值；每个平板上的菌落数目合适，每个平板上的菌落数目合适，便于准确计数；便于准确计数；初筛初筛l初筛是从分离得到的大量菌种中将合成目的产物的菌种筛选出来的过程。初筛可分为两种情况进行：la.平板筛选 对于在分离纯化阶段没有进行平板定性法挑选出来的菌株，可以先进行平板定性筛选。在初筛时，使用平板快速检测法，将复杂而费时的化学测定改为平板上肉眼可见的显色或生化反应，可以减少筛选的工作量，大幅度地提高筛选效率。微生物选择性分离的原理和方法微生物选择性分离的原理和方法l在菌种的分离筛选过程中，为了提高筛选的效率，通常要根据菌种的特性，设计具有选择性的分离筛选方案，通过控制营养和培养条件以有利于待分离菌株的生长和抑制非目的微生物的生长，或通过添加显色剂、指示剂以方便待分离菌株的挑选。l在常见选择性分离方法中，除了控制培养基营养成分和控制培养条件外，还有根据目的微生物的生理特性或利用某些代谢产物生化反应来设计选择培养基，通过观察微生物在选择培养基上生长状况或生化反应进行分离的方法。l这种利用平板的生化反应进行分离的方法有以下几种： 变色圈法 ; 透明圈法 ; 生长圈法 ; 抑菌圈法 .l变色圈法变色圈法 在底物平板上加入指示剂或显色剂，由于目的微生物分解底物或代谢产物引起平板上出现变色圈，使所需微生物能够被快速鉴别出来。l例如，用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板筛选果胶酶产生菌，菌落长成后加入0.2%刚果红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便出现绛红色水解圈；用加入溴百里酚蓝的平板培养基分离谷氨酸产生菌时，若平板上出现产酸菌，其菌落周围就变成黄色，可从黄色圈中挑取菌落。l透明圈法 在平板培养基中加入溶解性差的底物，使培养基浑浊，能够分解底物的微生物就会在菌落周围产生透明圈，根据透明圈的大小可以初步判断菌株利用底物的能力。l例如，以淀粉为唯一碳源的平板培养基分离淀粉酶产生菌时，形成菌落后用碘液浸涂，产淀粉酶菌株周围会出现透明的水解圈，据此可挑取所需菌落。l生长圈法 生长圈法所用的工具菌是一些营养缺陷型菌株。将待检菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少工具菌所需营养物的平板培养基上，进行培养，若某菌株能合成工具菌所需营养物，在该菌株的菌落周围就会形成一个浑浊的生长圈。l例如，用嘌呤缺陷型大肠杆菌作为工具菌，与不含嘌呤的培养基混合倒平板，在平板培养基上涂布含菌样品并恒温培养，周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌。 b.摇瓶发酵筛选 平板法是固体培养，与液体培养的条件差距较大，而摇瓶振荡培养法更接近发酵罐的培养条件，摇瓶发酵筛选得到的菌株易于推广，因此，经过平板定性筛选的菌株须进行摇瓶培养筛选。一般一个菌株接一个瓶，在一定转速的摇瓶机上以及适宜的温度下进行振荡培养，得到的发酵液进行目的产物检测或进行菌种活性测定，通过比较可以初步筛选出少量生产能力较高的菌株。l抑菌圈法 抑菌圈法所用的工具菌是一些抗生素的敏感菌。将待检菌涂布于含高浓度的工具菌的平板培养基上进行培养，若被检菌能分泌某些抑制工具菌生长的物质，如抗生素等，就会在被检菌的菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，从而使被检菌很容易被鉴别出来。l采用抑菌圈法，不仅能筛选抗生素，还能筛选某些酶类。例如，Meevootison等提出一套利用抑菌圈筛选青霉素酰化酶产生菌的方法。工具菌是一种对6-氨基青霉烷酸敏感而对苄青霉素有抗性的黏性沙雷氏菌，这种菌只有当苄青霉素尚未被别种微生物的青霉素酰化酶转化为6-氨基青霉烷酸时才能生长。将工具菌与苄青霉素混合于平板培养基中，然后将待检菌涂布于平板上，进行培养，周围出现抑菌圈的菌落就是青霉素酰化酶产生菌。 复筛l对初筛出来的菌株进行复筛时，通常采用摇瓶培养法，一般一个菌株至少要重复35个瓶，培养后的发酵液必须采用精确分析方法测定。l直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株，一般需经过进一步的人工改造才能真正用于工业发酵生产，因此，复筛出来的菌株通常作为进一步育种工作的原始菌株或出发菌株。复筛过程中，要结合各种培养条件进行筛选，在不同培养条件下进行试验，以便初步掌握野生型菌株适合的培养条件，为育种提供依据。 细菌分离：以乳酸菌为例细菌分离：以乳酸菌为例 取未成熟的酱醪样品取未成熟的酱醪样品1g至无菌磨口瓶中至无菌磨口瓶中 加麦芽汁至瓶口处，封塞，加麦芽汁至瓶口处，封塞，25培养培养24-48h培养基中长出绢丝状波动物，镜检培养基中长出绢丝状波动物，镜检 杆状，阳性染色杆状，阳性染色 初步断定乳酸菌初步断定乳酸菌 用选择性培养基分批富集培养用选择性培养基分批富集培养2-3代代稀释分离法分离单菌落，培养基为含麦芽汁、稀释分离法分离单菌落，培养基为含麦芽汁、CaCO3的琼脂培养基的琼脂培养基 根据透明圈挑选菌落根据透明圈挑选菌落 性能测定（镜检杆状，染色阳性；乳酸纸层析鉴定）性能测定（镜检杆状，染色阳性；乳酸纸层析鉴定） Rf值定性值定性 （有机酸呈黄斑点）（有机酸呈黄斑点） 乳酸生成量测定（滴定法）乳酸生成量测定（滴定法）放线菌的分离：放线菌的分离：以产链霉素菌种的分离为例（从退化菌种中筛选）以产链霉素菌种的分离为例（从退化菌种中筛选） 取工业发酵液（含孢子）样品取工业发酵液（含孢子）样品1 1环环放入带玻璃珠的装有放入带玻璃珠的装有10ml 无菌水的小三角瓶中，摇匀无菌水的小三角瓶中，摇匀采用稀释法制平板，获取单菌落采用稀释法制平板，获取单菌落 斜面保藏斜面保藏 高产菌恢复高产菌恢复根据高产菌的特点，选择目的菌落根据高产菌的特点，选择目的菌落 放大培养，发酵液性能测试放大培养，发酵液性能测试筛选模型：形态依据筛选模型：形态依据真菌的分离筛选真菌的分离筛选：以啤酒酵母的分离为例：以啤酒酵母的分离为例 取发酵液少许以取发酵液少许以10倍稀释成倍稀释成10-1-10-7 稀释分离法稀释分离法 取取0.1ml 加入固体培养基铺平皿（加入固体培养基铺平皿（2） 在麦芽汁固体培养基上，在麦芽汁固体培养基上，25培养培养48-72h 形态筛选形态筛选 根据正常株特点进行挑选，接种斜面备用根据正常株特点进行挑选，接种斜面备用 纯化，采用平板分离法进一步纯化，至少反复三次纯化，采用平板分离法进一步纯化，至少反复三次 生成子囊孢子速度测定生成子囊孢子速度测定 发酵力测定发酵力测定 性能测定性能测定 热死温度测定热死温度测定 凝集力测定凝集力测定 双乙酰含量测定双乙酰含量测定第三节 发酵工业菌种的鉴定一、一、微生物分类鉴定中的经典方法微生物分类鉴定中的经典方法（1 1）获得纯培养物；）获得纯培养物；（2 2）测定一系列指标）测定一系列指标（3 3）查权威菌种鉴定手册）查权威菌种鉴定手册（1）形态特征：形态特征：大小，排列，分化，结构，染色等大小，排列，分化，结构，染色等（2） 培 养 特 征 ：培 养 特 征 ：营 养要求，生长的物理 环境（酸碱营 养要求，生长的物理 环境（酸碱度，温湿度），菌落，菌苔，液体度，温湿度），菌落，菌苔，液体培养特征。培养特征。（3）代谢特征：代谢特征：微生物生命活动的方式。如：微生物生命活动的方式。如：I.M.Vit（4）化学组成特征：化学组成特征：细胞主要特征性化学成分的鉴定，如：细胞主要特征性化学成分的鉴定，如：细胞壁成分、细胞内含物细胞壁成分、细胞内含物（5）抗原特征：抗原特征：抗原成为化学组成的一个特殊方面，微抗原成为化学组成的一个特殊方面，微 生物具有许多不同类型的抗原。生物具有许多不同类型的抗原。（6）生态特征：生态特征：与其他生物的关系、自然界的分布、致与其他生物的关系、自然界的分布、致 病性等病性等经典的鉴定指标经典的鉴定指标第四节 发酵工业菌种的改良菌种选育改良的具体目标l提高目标提高目标产物产物的的产量产量 l提高目标提高目标产物产物的的纯度纯度，减少副产物，减少副产物 l改良菌种性状，改善改良菌种性状，改善发酵过程发酵过程 l改变生物改变生物合成途径合成途径，以获得高产的新产品，以获得高产的新产品 菌种代谢生理与分子生物学菌种代谢生理与分子生物学l育种的目的目的就是采取各种手段获得代谢调节机制不完善的高产菌株，使之过量积累人们所需的目标产物。l初级代谢：分解代谢体系（5-磷酸核糖、丙酮酸等）合成代谢体系（氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸等）l次级代谢：抗生素、生物碱、色素、毒素等。代谢调控机制代谢调控机制l酶合成的调节：调节酶的合成量进而调节代谢速率。l诱导（组成型酶初级代谢产物；诱导型酶-次级代谢产物）l阻遏：末端代谢产物阻遏、分解代谢产物阻遏l酶活性的调节：通过改变酶分子活性来调节新陈代谢的速率。包括酶活性的激活和抑制。 发酵工业菌种改良方法l常规育种常规育种(诱变育种诱变育种)l细胞工程育种细胞工程育种 l基于代谢调节的育种技术基于代谢调节的育种技术 l基因工程育种基因工程育种 l蛋白质工程育种蛋白质工程育种 l代谢工程育种代谢工程育种 诱变育种诱变育种的基本原理诱变育种的基本原理l诱变育种的理论基础是诱变育种的理论基础是基因突变基因突变。l所谓基因突变基因突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。l突变主要包括染色体畸变和基因突变两大类。l染色体畸变染色体畸变是指染色体或DNA片段的缺失、易位、逆位、重复等，而基因突变基因突变是指DNA分子结构中的某一部位发生变化（又称点突变）。l根据突变发生的原因又可分为自然突变和诱发突变自然突变和诱发突变。l所谓自然突变自然突变是指在自然条件下出现的基因突变，而诱发突变诱发突变是指用各种物理、化学因素人工诱发的基因突变。诱变因素的种类很多，有物理的、化学的和生物的三大类。l经诱变处理后，微生物的遗传物质，DNA和RNA的化学结构发生改变，从而引起微生物的遗传变异。由于引进了诱变剂的处理，故诱变育种使菌种发生突变的频率和变异的幅度得到了提高，从而使筛选获得优良特性的变异菌株的几率得到了提高。（五）基因突变及其机制仅影响一对碱基影响一段染色体 出发菌株的选择出发菌株的选择 菌悬液的制备菌悬液的制备 前培养前培养 诱变诱变 变异菌株的分离和筛选变异菌株的分离和筛选2022-7-6发酵工艺原理64 诱变处理后再经液体培养和不经培养的比较诱变处理后再经液体培养和不经培养的比较诱变育种中需要考虑的因素诱变育种中需要考虑的因素l选择合适的出发菌株：产量高、对诱变剂的敏感性大、变异幅度广。l复合诱变剂的使用：NTG、紫外线等。 常用诱变剂及其类别常用诱变剂及其类别物理诱变剂化学诱变剂生物诱变剂碱基类似物与碱基反应的物质在DNA分子中插入或缺失一个或几个碱基物质紫外线快中子X射线射线激光2-氨基嘌呤5-溴尿嘧啶8-氮鸟嘌呤8-AG硫酸二乙酯（DES）甲基磺酸乙酯（EMS）亚硝基胍（NTG）亚硝基甲基脲（NMU）亚硝基乙基脲（NEU）亚硝酸（NA）氮芥（NM）4-硝基喹啉1-氧化物（4NQO）乙烯亚胺（EI）羟胺吖啶类物质ICR类物质噬菌体ICR是美国肿瘤研究所（The Institute for Cancer Research）的缩写，ICR化合物是该研究所合成的吖啶类的氮芥衍生物。l诱变剂剂量的选择：以致死剂量作为选择适宜剂量的依据。合适剂量：能扩大变异幅度又能促使 变异移向正变范围的剂量通常采用低剂量、长时间处理。 凡在提高诱变率的基础上，既能扩大变异幅度，又能促使变异移向正变范围的剂量，就是合适的剂量。两条重要的实验曲线两条重要的实验曲线横坐标横坐标纵坐标纵坐标 剂量存活率曲线剂量存活率曲线诱变剂的诱变剂的剂量剂量细胞存活数的细胞存活数的对数值对数值 剂量诱变率曲线剂量诱变率曲线诱变剂的诱变剂的剂量剂量诱变后获得的诱变后获得的突变细胞数突变细胞数l变异菌株的筛选：从菌落形态变异类型着手。如在灰黄霉素产生菌荨麻青霉的育种中，曾发现菌落的棕红色变深如在灰黄霉素产生菌荨麻青霉的育种中，曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提高。者往往产量有所提高。 新诱变因子及诱变技术进展新诱变因子及诱变技术进展l低能离子束诱变：是利用是利用离子注入设备离子注入设备产生离产生离子束子束(4060keV)(4060keV)并注入生物体引起遗传物质的并注入生物体引起遗传物质的永久改变永久改变, ,然后从变异菌株中选育优良菌株的然后从变异菌株中选育优良菌株的方法。方法。类型类型示例示例活性离子N+、C+、O+、H+、P+惰性离子Ar+、Ne+金属离子Fe+、Zn2+ 展望展望l尽管离子诱变存在一些约束如离子种类、诱变材尽管离子诱变存在一些约束如离子种类、诱变材料和生物学效应难以解释，但待一些理论得到更料和生物学效应难以解释，但待一些理论得到更好解决，将可利用离子束选择性破坏一部分细胞，好解决，将可利用离子束选择性破坏一部分细胞，切断基因、观察损伤和修复，并通过消除染色体切断基因、观察损伤和修复，并通过消除染色体或染色体的某些片段达到融合的目的，可大大减或染色体的某些片段达到融合的目的，可大大减少突变菌株筛选的工作量，与此同时可获得更多少突变菌株筛选的工作量，与此同时可获得更多表型的突变菌株，极大的丰富动植物界和提高工表型的突变菌株，极大的丰富动植物界和提高工业产量。业产量。激光辐射诱变和微波电磁辐射诱变激光辐射诱变和微波电磁辐射诱变l激光辐射诱变：量子流光微粒，引起DNA和RNA改变，导致酶激活或钝化，引起细胞分裂和细胞代谢活动改变。l微波电磁辐射诱变：场力和转化能协同作用原生质体诱变原生质体诱变l原生质体对理化因素的敏感性更强。筛选方法筛选方法l平皿快速检测法l形态变异的利用l高通量筛选 平皿快速检测法平皿快速检测法A、纸片培养显色法、纸片培养显色法:浸有指示剂滤纸B、变色圈法、变色圈法:直接用显色剂或指示剂C、透明圈法、透明圈法:混浊底物被分解后形成透明圈。如可溶性淀粉、碳酸钙等。 D、生长圈法、生长圈法:利用某些具有特殊营养要求的微生物作为工具菌E、抑制圈法、抑制圈法 在琼脂平板上，通过观察测定某突变菌落周围蛋白酶水解圈的大小、淀粉酶变色圈（用碘液使淀粉显色）的大小，氨基酸显色圈（将菌落用打孔机取下，转移到滤纸上，再用茚三酮试剂显色）的大小，柠檬酸变色圈（可在厚滤纸上培养，用溴甲酚绿作指示剂）的大小，抗生素抑制圈的大小，指示菌生长圈的大小（测定生长因子产生），纤维素酶对纤维素水解圈（用刚果红染色）的大小，外毒素的沉淀反应圈的大小等，均可为初筛工作中估计某突变株代谢产物量的“形态”指标。细胞工程育种细胞工程育种-杂交育种和原生质体融合杂交育种和原生质体融合l杂交育种的遗传标记（营养缺陷型标记、抗性标记、温度敏感性标记、其它性状标记）l细菌的杂交育种：接合、转导、转化l供体菌（“雄性”）通过性菌毛与受体菌（“雌性”）直接接触，把F质粒或其携带的不同长度的核基因组片段传递给后者，使后者获得若干新遗传性状的现象，称为接合。通过接合而获得新遗传性状的受体细胞，就是接合子（conjugant）。l放线菌的杂交育种：在原理上类似大肠杆菌。方法上类似霉菌。图2-6.l必须是感受态。霉菌的杂交育种：有性生殖、准性生殖霉菌的杂交育种：有性生殖、准性生殖l准性生殖是一种类似于有性生殖，但比它更为准性生殖是一种类似于有性生殖，但比它更为原始原始的一种两性生殖方式，这是一种在同种而的一种两性生殖方式，这是一种在同种而不同菌株的不同菌株的体细胞间体细胞间发生融合，它可不借减数发生融合，它可不借减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子。分裂而导致低频率基因重组并产生重组子。 准性杂交的步骤准性杂交的步骤1） 菌丝联结（菌丝联结（amastomosis)： 发生在形状相同而遗传型有异的同一菌种两个不同发生在形状相同而遗传型有异的同一菌种两个不同菌株间。频率极低。菌株间。频率极低。2） 形成异核体形成异核体(heterocaryon)： 体细胞联结，原有的单倍体核形成了双相异核体。体细胞联结，原有的单倍体核形成了双相异核体。3）核融合）核融合(nuclear fusion)： 异核体中的双核偶尔可以发生核融合，产生双倍体杂合子核。异核体中的双核偶尔可以发生核融合，产生双倍体杂合子核。4）体细胞交换）体细胞交换(somatic crossing-over)和单倍体化：和单倍体化： 体细胞交换即体细胞中染色体间的交换。体细胞交换即体细胞中染色体间的交换。 原生质体融合原生质体融合l使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并发生遗传重组以产生融合子（，并发生遗传重组以产生融合子（fusantfusant）的）的过程。过程。l已成功地应用与植物细胞、真菌细胞、属间、科间的远缘细胞融合，融合产物含两亲代细胞基因组。选择两个有特殊价值的并带有选择性遗传标记的细胞作为亲本选择两个有特殊价值的并带有选择性遗传标记的细胞作为亲本脱壁酶脱壁酶细菌或放线菌可用细菌或放线菌可用溶菌酶溶菌酶或或青霉素青霉素处理，处理，真菌可用真菌可用蜗牛酶蜗牛酶或其他相应的或其他相应的脱壁酶脱壁酶等等离心聚集离心聚集在高渗溶液中稀释在高渗溶液中稀释加入促融合剂或电脉冲加入促融合剂或电脉冲各种选择性培养基各种选择性培养基原生质体融合的主要步骤是：原生质体融合的主要步骤是：基于代谢调节的育种技术基于代谢调节的育种技术l代谢工程育种（第三代基因工程）：通过特定突变型的选育，达到改变代谢通路，降低支路代谢终产物的生产或切断支路代谢途径及提高细胞膜透性，使代谢流向目标产物积累的方向发展。1、组成型突变的育种：操纵子或调节基因突变引起酶合成诱导机制失灵，菌株不经诱导也能合成酶，或不受终产物阻遏的调节突变型。l限量诱导物恒化培养：诱变后接到低浓度的诱导物的恒化器中连续培养。l循环培养：在含诱导物和不含诱导物的培养基上交替培养。2、抗分解调节突变株的选育：抗分解阻遏和抗分解抑制的突变。l解除碳源调节突变株的选育：葡萄糖l解除氮源分解调节突变株的选育：铵盐和其他快速利用的氮源。3、营养缺陷型在代谢调节育种中的应用：使发生障碍前一步的中间代谢产物积累。4、抗反馈调节突变株的选育：解除合成代谢反馈调节机制，终产物不断积累。抗反馈突变型和抗阻遏突变型。应用营养缺陷型菌株解除正常的反馈调节应用营养缺陷型菌株解除正常的反馈调节 天冬氨酸天冬氨酸 磷酸天冬氨酸 半醛高丝氨酸 苏氨 酸 甲硫 氨酸 C.glutamicum的代谢调节与赖氨酸生产赖氨酸为反馈抑制为阻遏AKHSDH细胞膜透性突变株的选育细胞膜透性突变株的选育l营养缺陷型突变株的选育可改变细胞膜通透性l温度敏感突变株的选育l溶菌酶敏感突变株的选育 基因工程育种基因工程育种l体外重组体外重组DNA技术或称基因工程、遗技术或称基因工程、遗传工程，是以分子遗传学的理论为基传工程，是以分子遗传学的理论为基础，综合分子生物学和微生物遗传学础，综合分子生物学和微生物遗传学的最新技术而发展起来的一门新兴技的最新技术而发展起来的一门新兴技术。术。l它是现代生物技术的一个重要组成方它是现代生物技术的一个重要组成方面，在工业微生物学上提供了巨大的面，在工业微生物学上提供了巨大的创造具有工业应用价值的生产菌株的创造具有工业应用价值的生产菌株的潜力。潜力。1、基因工程的基本步骤、基因工程的基本步骤l目的基因的分离目的基因的分离l载体的选择与制备载体的选择与制备l目的基因与载体连接成目的基因与载体连接成重组重组DNAl引入宿主细胞引入宿主细胞l重组体的选择和鉴定重组体的选择和鉴定l外源基因的表达外源基因的表达l原核表达系统常用：原核表达系统常用：大肠杆菌（大肠杆菌（E.coli），），枯枯草芽孢杆菌（草芽孢杆菌（B.subtilis）、链霉菌等）、链霉菌等l真核表达系统常用：真核表达系统常用：酿酒酵母（酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），），巴斯德毕赤酵母巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）蛋白质育种工程蛋白质育种工程l寻找新的物种，再从中分离筛选新蛋白l或者对天然功能蛋白进行改造l体外蛋白质改造已经成为获得新功能蛋白质的方法。l蛋白质工程分为理性设计（定点改造、定向改造）和非理性的体外定向进化（随机化突变、定向筛选）定点突变技术定点突变技术l定点突变技术是基于蛋白质工程的理论，以蛋白质结构和功能的计算机预测为基础，设计新蛋白质的氨基酸序列，应用重组DNA技术设计并构建具有新性质的蛋白质或酶的过程。l改变蛋白质的一级结构l普遍用于菌种改良定向进化技术定向进化技术l体外模拟自然进化过程，使基因发生大量变异并定向选择出所需性质和功能的蛋白质。l特点：依赖基因随机突变，建立突变体文库l方法：易错PCR；DNA随机重组（图2-8）代谢工程的定义代谢工程的定义l利用多基因重组技术有目的地对细胞代谢途径利用多基因重组技术有目的地对细胞代谢途径进行修饰、改造，改变细胞特性，并与细胞基进行修饰、改造，改变细胞特性，并与细胞基因调控、代谢调控及生化工程相结合，为实现因调控、代谢调控及生化工程相结合，为实现构建新的代谢途径，生产特定目的产物而发展构建新的代谢途径，生产特定目的产物而发展起来的一个新的学科领域。起来的一个新的学科领域。l又称作途径工程，是多基因的基因工程。又称作途径工程，是多基因的基因工程。代谢工程育种思路代谢工程育种思路1. 1. 改变代谢流：改变代谢流：改变分支代谢途径的流向，阻改变分支代谢途径的流向，阻断有害代谢产物的合成。断有害代谢产物的合成。（1 1）加速限速反应）加速限速反应（2 2）改变分支代谢途径流向：）改变分支代谢途径流向：提高代谢分支点提高代谢分支点的某一分支代谢途径酶系的活力，在与另外的的某一分支代谢途径酶系的活力，在与另外的分支代谢途径的竞争中占有优势，可以提高目分支代谢途径的竞争中占有优势，可以提高目的代谢末端产物的产量。的代谢末端产物的产量。（3 3）构建代谢旁路）构建代谢旁路（4 4）改变能量代谢途径）改变能量代谢途径2. 2. 扩展代谢途径扩展代谢途径 （1 1）在引入外源基因后，使原来的代谢途）在引入外源基因后，使原来的代谢途径向后延伸，产生新的末端代谢产物。径向后延伸，产生新的末端代谢产物。 （2 2）使原来的代谢途径向前延伸，可以利）使原来的代谢途径向前延伸，可以利用新的原料生物合成代谢末端产物。用新的原料生物合成代谢末端产物。 3. 3. 转移或构建新的代谢途径转移或构建新的代谢途径 1)转移代谢途径转移代谢途径: 为生产某一新的化学结构的代为生产某一新的化学结构的代谢产物，将催化某一代谢途径的基因组克隆到谢产物，将催化某一代谢途径的基因组克隆到另一不具备该种能力的微生物中，达到代谢途另一不具备该种能力的微生物中，达到代谢途径转移的目的，使之具备生产该种新化合物的径转移的目的，使之具备生产该种新化合物的能力。能力。 2)构建新的代谢途径构建新的代谢途径: 利用基因工程手段，通过利用基因工程手段，通过克隆少数基因将原来细胞中无关的两条代谢途克隆少数基因将原来细胞中无关的两条代谢途径桥连在一起，形成新的代谢途径。径桥连在一起，形成新的代谢途径。组合生物合成育种组合生物合成育种l通过合成化合物库进行高效率的筛选。l一次性同步合成成千上万结构不同的分子即组合库，然后进行生物活性测定和化合物结构鉴定。（图2-9）反向生物工程育种反向生物工程育种l反向代谢工程针对限制生物活性的主要因素，在相关生物种类识别希望的表型，确定该表型的决定基因，通过重组DNA技术将该基因在需改造的生物中克隆表达出来。l策略：图2-10l关键：确定希望表型的遗传基础。第四节 发酵工业菌种保藏工业生产菌种的退化现象及原因工业生产菌种的退化现象及原因 菌种退化（degeneration）主要指生产菌种或选育过程中筛选出来的优良菌株，由于连续传代或保藏之后，群体中某些生理和形态特征逐渐退化或完全丧失（包括菌株产孢子能力、发酵主产物产量下降）的现象。1、退化的表现菌落和细胞形态的改变：如苏云金芽孢杆菌的芽孢和伴孢晶体变得小而少；生长速度缓慢，产孢子越来越少：如细黄链霉菌的菌苔变薄、生长缓慢，不再产生典型而丰富的橘红色分生孢子层；抗不良环境条件（抗噬菌体、抗低温等）能力的减弱。代谢产物生产能力下降：如藤仓赤霉产赤霉素能力下降；2 2、退化的原因、退化的原因 1）基因突变 那些控制生产性状的基因发生负突变。 2）连续传代3 3、菌种退化的防治、菌种退化的防治 1）从菌种选育方面考虑在育种过程中，应尽可能使用孢子或单核菌株，避免对多核细胞进行处理；在使单链突变的同时，使另一条单链丧失模板作用，以减少出现分离回复现象；诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化，以保证菌株的“纯度”。2）控制传代次数 如产腺苷的芽孢杆菌黄嘌呤营养缺陷型菌株，回复子的比例随传代次数的增加而增加，腺苷产量也随之下降。 3）创造良好的培养条件在进行栖土曲霉培养时，温度从28-30提高到33-34，可防止产孢子能力的衰退。4）利用不易衰退的细胞传代 在放线菌和霉菌中，由于其菌丝细胞常含有几个细胞核，若用菌丝接种就易出现衰退，而孢子一般是单核的，用于接种，就不会发生这类现象。有些霉菌如用其分生孢子传代易于衰退，而改用其子囊孢子接种，则能避免退化。 5）采用有效的菌种保藏方法 1、纯种分离法 在衰退菌种的细胞群中，一般还存在仍保持原有性状的个体，设法对其进行分离纯化。2、淘汰已衰退的个体 采用高温或低温及其方法淘汰衰退的个体。 3、选择合适的培养条件 如平菇菌种在PDA培养基上连续传代会导致菌种衰退，而在PDA综合培养基（PDA中添加维生素和蛋白胨等）中培养则能使衰退的菌种复壮。（三）工业生产菌种的保藏（三）工业生产菌种的保藏 v菌种保藏的意义： 保持菌种优良性状的稳定，满足生产需要。v菌种保藏的基本原理： 根据微生物的生理生化特性，人为地创造条件，使微生物处于代谢不活泼、生长繁殖受到抑制的休眠状态，以减少菌种的变异。一般可通过降低培养营养成分、低温、干燥和缺氧等方法，达到防止突变、保持纯种的目的。2穿刺保藏法：常用于保藏各种需气性细菌。 1斜面保藏法 这是一种最基本的方法，适用范围广，细菌、真菌和放线菌都可应用。 3沙土管干燥保藏法： 这种方法适用于形成芽孢的细菌、形成孢子的丝状真菌和放线菌。其原理是将微生物吸附在各种载体上，干燥后保藏。4冷冻干燥保藏法： 其基本原理是将微生物或孢子冷冻，然后在减压的情况下使水分升华，使细胞的代谢、生理等生命活动处在停止状态下长期保藏。 5液氮保藏法：其方法是将浓的悬液加入灭菌后的分散剂中，细菌加入最终浓度为10%的甘油或5%二甲基亚砜（DMSO）作为防冻的保护剂。 6低温保藏法：大多数微生物可在-20以下的低温中保藏。使用密封性能好的螺旋口小管，加入12mL的菌液，直接放入低温冰箱中保藏。 （四）、国内外菌种保藏机构（四）、国内外菌种保藏机构 1、我国的主要微生物菌种保藏机构1）普通微生物菌种保藏管理中心中国科学院微生物研究所、中国科学院武汉病毒研究所2）农业微生物菌种保藏管理中心 中国农科院土壤肥料研究所3）工业微生物菌种保藏管理中心 食品发酵工业科学研究院 4）医学微生物菌种保藏管理中心中国医学科学院皮肤研究所、卫生部药品生物制品检定所、中国医学科学院病毒研究所5）抗生素菌种保藏管理中心 中国医学科学院抗生素研究所、四川抗生素工业研究院、华北药厂抗生素研究所6）兽医微生物菌种保藏管理中心 农业部兽医药品监察所 2 2、国外主要的微生物菌种保藏机构、国外主要的微生物菌种保藏机构 1）美国标准菌种收藏所ATCC2）美国冷泉港研究室CSH3）日本东京大学应用微生物研究所IAM4）日本大阪发酵研究所IFO 5）日本东京科研化学有限公司KCC6）英国国